【摘 要】
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人生长激素(Human Growth Hormone,HGH)是调节人体生长发育和新陈代谢的重要多肽类激素.Bac-to-Bac系统是一种新颖的杆状病毒表达载体系统.利用Bac-to-Bac系统,构建及筛选重
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人生长激素(Human Growth Hormone,HGH)是调节人体生长发育和新陈代谢的重要多肽类激素.Bac-to-Bac系统是一种新颖的杆状病毒表达载体系统.利用Bac-to-Bac系统,构建及筛选重组病毒比传统的杆状病毒表达系统更为高效简单快捷,业已成为研究真核基因表达较为理想的工具.该文在Bac-to-Bac系统中,以重组转移载体pFastBac-Δ0-hGH为模板,用反向PCR法缺失原多角体基因起始密码子到外源基因hGH起始密码子ATG之间的序列,转化DH5α,提取质粒转化进入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac后发生转座,得到含hGH cDNA的重组穿梭载体rBacmid-Δ4-hGH.再将这重组穿梭载体转染贴壁培养的昆虫细胞Sf9,得到重组病毒rAcV-Bac-Δ4-hGH.将不同的重组病毒rAcV-Bac-Δ0-hGH、rAcV-Bac-Δ1-hGH、rAcV-Bac-Δ2-hGH、rAcV-Bac-Δ3-hGH和rAcV-Bac-Δ4-hGH以相同的感染复数感染相同密度的昆虫细胞Sf9后,通过mRNA斑点杂交分析mRNA的丰度大小为:rAcV-Bac-Δ1-hGH>rAcV-Bac-Δ0-hGH>rAcV-Bac-Δ4-hGH>rAcV-Bac-Δ3-hGH>rAcV-Bac-Δ2-hGH;培养上清中HGH的表达量测定结果为:rAcV-Bac-Δ1-hGH>rAcV-Bac-Δ4-hGH>rAcV-Bac-Δ3-hGH>rAcV-Bac-Δ0-hGH>rAcV-Bac-Δ2-hGH.用1mM羟基尿同步化sf9,培养上清中HGH的表达量测定结果表明释放0小时后感染表达量降低,释放6小时后感染表达量提高.用1mM羟基尿同步化sf21,结果与sf9相似.表明5-UTR中的-3位碱基、茎环(二级结构)、一级结构的长短以及细胞同步化在转录和翻译上都是hGH基因表达的重要影响因素,这无论是在理论上还是在应用上都具有重要意义.
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