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白介素-1(IL-1)和白介素-6(IL-6)是对机体免疫功能和生殖功能都具有重要调节作用的细胞因子,反刍动物子宫和胚胎中均能分泌IL1和IL-6。
参照Genbank中发表的印度河流型水牛IL-1β和IL-6细胞因子的基因序列,分别设计一对特异性引物,从广西本地沼泽型成年水牛的外周血单核细胞经刀豆蛋白A诱导,体外培养,提取细胞中RNA为模板,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增水牛IL-1β和IL-6的基因片段。扩增的片段纯化后连接到pMD18-T载体,然后转入到大肠杆菌中扩增、培养和测序:对菌液进行质粒抽提进行双酶切鉴定。结果表明:扩增的IL-1β基因全长804bp,包括一个全长为801bp的完整编码区(ORF),共编码268个氨基酸,包含信号肽和成熟肽序列。同源性比较显示,广西沼泽型水牛IL-1β基因与GenBank报道的印度水牛的IL-1β基因序列的同源性为99.4%,与黄牛IL-1β基因序列同源性为98.6%;扩增的IL-6基因全长671bp,包括一个全长为627bp的完整编码区(ORF),共编码224个氨基酸,包含信号肽和成熟肽序列。同源性比较显示,广西沼泽型水牛IL-6基因与GenBank报道的印度水牛的IL-6基因序列的同源性为99.8%,与黄牛IL-6基因序列同源性为98.7%。
在水牛发情周期中血清IL-1和IL-6的浓度动态变化规律的研究,均选用临床健康、无繁殖方面疾病、胎次均为第3胎、饲养方式相同,年龄、体重相近的10头摩拉母水牛;动态采集在发情周期中的血液样本,采用酶联免疫方法检测血清中IL-1和IL-6的浓度。结果发现,在发情周期过程中IL-1和IL-6浓度呈波浪式变化,出现了3个峰值,推测这可能与卵泡发育波有关。
本实验成功地克隆出广西沼泽型成年水牛的IL-1β和IL-6基因,而且查明了在发情周期中IL-1和IL-6血清浓度的动态变化,为今后开展水牛细胞因子研究奠定了基础。