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体细胞诱导为多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术的出现引起了全球广泛的关注，其在体细胞重编程机理和再生医学应用等方面的研究中具有不可比拟的价值和优越性，并且避免了因使用胚胎干细胞而涉及到的伦理问题。牛作为大家畜中的最重要物种，为人类提供了绝大多数的肉和奶制品，对其体细胞诱导为多能干细胞原理和技术进行深入研究显得尤其重要。本研究对牛诱导多能干细胞(biPSCs)的制备方法和原理、生物学特性等进行系统的探讨，以期推动其他大家畜诱导多能性的研究。
1.建立了无病毒介导生产牛诱导多能干细胞的方法。
研究结果显示，本研究成功构建两个包含不同转录因子顺序的质粒载体pOSKM和pKMOS，并使用脂质体法和电穿孔法介导质粒转染两种方法将所构建质粒载体成功转染牛成纤维细胞，细胞质粒转染12天后检测到4转录因子内源性表达；2i/LIF培养液对成纤维细胞早期重编程有重要作用，PD有效的抑制牛成纤维细胞MEK1/2信号通路，CHIR显著增加牛成纤维细胞的碱性磷酸酶(AP)活性；两种方法转染后细胞在2i/LIF培养液中培养均可形成类iPS克隆。
2.优化和完善了牛多能干细胞诱导和培养体系。
研究结果显示，两个不同转录因子顺序的质粒(pOSKM和pKMOS)对biPSCs的生产没有显著影响；脂质体转染法无论从单细胞Sox2阳性率还是从类iPS克隆形成率都显著高于电转染法(15.8% vs2.1%；63.7 vs23.4，p<0.05)；胚胎和胎儿来源的细胞其转染效率显著高于成体细胞，而转基因的胎儿细胞与成体细胞在转染效率方面无显著差异。在类iPS克隆形成率方面，胎儿成纤维细胞系BFF64(♂)显著低于胚胎成纤维细胞系，但显著高于其他所有细胞系，成年体细胞系与转基因胎儿细胞系差异不显著，胎儿成纤维细胞系最优；玻璃材质上培养的转染后细胞无论是克隆形成时间和AP阳性克隆形成率都显著优于塑料材质，8孔培养玻片出现克隆的时间最早，10 mm细胞爬片形成AP阳性克隆数量最多；转染细胞培养于饲养层或层粘连蛋白处理的培养皿中，AP阳性克隆形成率显著高于其他组，而二者之间无显著差别；低氧培养体系(5%O2)培养转染后细胞，与正常20%O2培养体系比较，发现对biPSCs的生产没有显著影响。
3.初步弄清了牛诱导多能干细胞的生物学特性。
研究结果发现，biPSCs集落性生长形成克隆，克隆隆起呈岛状，细胞亮度高，边缘整齐光滑折光性强，细胞排列致密，无明显细胞间隔，与牛类胚胎干细胞克隆、小鼠ES/iPS克隆相似且为AP染色阳性；RT-PCR结果表明biPSCs表达多能性标志基因OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、CDH1、NANOG、DPPA3、SALLA、SOCS3和ZFP42，且表达STAT3，但不表达外胚层干细胞特异性基因T-BRACHYURY、FGF5和LEFTY2；免疫组化染色结果显示biPSCs表达表面抗原TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3和SSEA-4，但不表达SSEA-1，并表达SOX2和OCT4蛋白；biPSCs具有端粒酶活性和正常染色体核型(60条)；biPSCs体外延时培养可以自发分化成类上皮细胞、类神经细胞和类脂肪细胞等多种类型的细胞，体外悬浮培养可形成拟胚体，并能在体内分化形成畸胎瘤。
4.对牛诱导多能干细胞外源转录因子的表达模式及增值与凋亡性能进行了研究。
研究结果发现，转染后初期细胞重编程主要依靠转录因子外源表达来推动，18天后biPSCs多能性的维持主要依靠转录因子的内源表达；EdU标记细胞增殖检测结果发现，转染后细胞在2i/LIF培养液中培养的过程中增殖率迅速下降，克隆形成前细胞迁移频繁，细胞在重编程过程中的迁移对类iPS克隆形成非常重要。增殖特异性标记蛋白Ki67和标志性抗原PCNA免疫组化染色获得了相似的结果；细胞凋亡检测发现转染后16天牛类iPS克隆，仅有1±0.4%细胞发生凋亡，而这一阶段细胞增殖率为1±0.5%，因此98±0.9%细胞处于细胞沉默状态；类iPS克隆传代后有较高的再贴壁率，但2i/LIF培养液不支持传代后牛类iPS克隆的增殖。
结论：本研究构建了两个包含不同转录因子顺序的外源质粒，成功的使用脂质体和电穿孔法对牛成纤维细胞进行转染，并在2i/LIF培养液培养条件下成功制作biPSCs；对影响biPSCs生产效率的多个因素进行探讨，其中脂质体法优于电穿孔法、牛胚胎成纤维细胞优于其他种类细胞、玻璃材质培养容器优于塑料材质、饲养层和层粘连蛋白(LN)预处理优于其他预处理；实验所得biPSCs具有典型的多能干细胞生物学特性，具有AP活性和端粒酶活性、表达多能干细胞标志性基因和表面抗原、具有正常的染色体核型、体内外均具有可分化为包括三个胚层在内多种类型组织和细胞的潜能；牛成纤维细胞在重编程前期四转录因子主要依靠质粒外源性表达来维持，重编程后期基本转变为内源性表达、在2i/LIF培养液中98±0.9%的重编程后细胞发生细胞沉默、类iPS克隆传代后有较高的再贴壁率，但2i/LIF培养液不支持传代后biPSCs的增殖。