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马铃薯在加工过程中易发生褐变,严重影响了其加工产品的外观品质和营养价值,给马铃薯加工产业造成了很大的经济损失。目前关于马铃薯酶促褐变的研究主要从生理生化方面开展,缺乏对其分子机制的探究。实验室前期采用RNA-Seq技术比较了褐变程度不同的马铃薯间转录水平的差异,发现易褐变与不易褐变的马铃薯中蛋白酶抑制子基因表达差异显著,推测蛋白酶抑制子在马铃薯褐变抗性方面发挥重要的作用,但未进行深入研究来证明这一假设。因此,研究蛋白酶抑制子对马铃薯酶促褐变的影响及作用机制,对研发马铃薯酶促褐变控制新技术及抗褐变马铃薯分子育种具有重要的现实和科学意义。本研究首先通过提高基因筛选压力,对褐变程度不同的马铃薯RNA-Seq结果进行重新分析,筛选到9个蛋白酶抑制子基因。通过GO聚类与同源性分析最终选择了4个蛋白酶抑制子基因StPI 143、StPI 146、StPI 128和StPI 9511作为研究对象。使用农杆菌介导的马铃薯转化法获得过表达转基因植株,通过温室种植得到转基因块茎,研究蛋白酶抑制子对马铃薯酶促褐变及生理生化机制的影响。此外,通过烟草瞬时转化分析半胱氨酸蛋白酶抑制子StPI 146和StPI 143的亚细胞定位,构建马铃薯酵母文库进行mating法筛库,结合酵母杂交、Pull-down等实验确定与半胱氨酸蛋白酶抑制子发生互作的蛋白,初步阐述过表达StPI 146和StPI 143影响马铃薯酶促褐变的分子机制。主要结果如下:（1）通过对褐变程度不同的马铃薯（Kexin#4和Kexin#13,采后愈伤处理及其对照）进行转录组学分析,筛选到37个共同差异基因。其中,与褐变严重的马铃薯（Kexin#4与采后愈伤处理的对照）相比,褐变轻的马铃薯（Kexin#13与采后愈伤处理）中共同上调基因有15个包括9个蛋白酶抑制子基因。差异基因的GO（Gene ontology）聚类分析显示富集到的功能分类主要集中在内源水解酶活性、催化活性和肽酶活性的调控方面,并且这些类别主要由蛋白酶抑制子基因组成。因此推测蛋白酶抑制子可能通过调节马铃薯中内源水解酶的活性和肽酶活性在酶促褐变中发挥重要作用。（2）核苷酸与氨基酸序列分析显示蛋白酶抑制子基因StPI 146与StPI 143的一致性为94.92%,具有较高的相似性。原核表达并纯化获得蛋白StPI 146后,用其体外处理木瓜蛋白酶发现1.0 mg/L与2.0 mg/L的StPI 146蛋白对木瓜蛋白酶活性的抑制率均约为45%左右,证明其具有半胱氨酸蛋白酶抑制子的活性。从马铃薯中克隆出StPI 146与StPI 143基因并进行过表达,温室种植得到马铃薯块茎。鲜切后进行褐变观察,结果发现过表达StPI 146与StPI 143马铃薯褐变程度均显著低于野生型马铃薯。过表达StPI146马铃薯三个株系的蛋白酶活性（48.54×10~3 U/kg、41.95×10~3 U/kg和56.85×10~3 U/kg）与StPI 143马铃薯中的蛋白酶活性（37.75×10~3 U/kg、40.75×10~3 U/kg和49.89×10~3 U/kg）均显著低于野生型（75.77×10~3 U/kg）。此外,过表达StPI 146马铃薯的总游离氨基酸含量（6.45 g/kg、5.80 g/kg、5.95 g/kg）与过表达StPI 143总游离氨基酸含量（6.42 g/kg、5.97 g/kg、5.76 g/kg）也均低于野生型（8.72 g/kg）。但过表达StPI 146和StPI 143并没有降低马铃薯块茎中PPO酶的活性。（3）通过外源添加的方式,将过表达StPI 143和StPI 146转基因马铃薯块茎中缺少的酪氨酸或总游离氨基酸回补到过表达StPI 143和StPI 146马铃薯浆液中,使其与野生型马铃薯浆液中的酪氨酸或总游离氨基酸含量相等。未回补氨基酸的过表达StPI 143和StPI 146马铃薯浆液的褐变度在0.5-0.6之间;回补差量酪氨酸后,二者的褐变度均增加至0.7左右;而回补总游离氨基酸后浆液的褐变度增加至0.91左右,与野生型马铃薯浆液褐变度0.93相差并不显著。此结果表明游离氨基酸的增加能够促进马铃薯浆液的褐变,且回补总游离氨基酸的浆液褐变度大于只回补酪氨酸的浆液褐变度,与野生型浆液的褐变度接近。这一结果说明除酪氨酸外,总游离氨基酸积累的减少是过表达StPI143和StPI 146延缓马铃薯酶促褐变的重要因素。（4）外源天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A处理马铃薯浆液显著抑制了浆液的褐变,并降低了浆液中PPO酶的活性。从马铃薯中克隆天冬氨酸蛋白酶抑制子StPI 9511基因全长,并转入植株中,获得过表达转基因块茎。结果发现过表达StPI 9511显著抑制了马铃薯块茎的酶促褐变。与野生型相比,过表达StPI 9511三个株系的马铃薯块茎中蛋白酶活性分别降低了45%、46%和34%,总游离氨基酸的积累减少18%、33%和38%,PPO酶活性分别下降了27%、32%和29%。此外,过表达StPI 9511提高了块茎中抗氧化酶SOD和CAT的活性,降低了H2O2和O2˙-的积累。外源回补差量的氨基酸到过表达StPI 9511马铃薯浆液中促进了浆液的褐变,但其褐变程度仍低于野生型浆液的褐变程度。因此,过表达StPI 9511除了调控游离氨基酸的积累来减轻马铃薯的褐变外,还可以通过抑制PPO酶活,增强抗氧化能力来抑制马铃薯的酶促褐变。（5）半胱氨酸蛋白酶抑制子StPI 143与StPI 146亚细胞定位于细胞核及细胞质中。构建酵母文库,通过mating法筛库得到可能与StPI 143、StPI 146互作的具有泛素化结构域的蛋白酶体识别因子DSK2B,通过酵母杂交及Pull-down实验证明蛋白StPI 143、StPI 146能够与DSK2B发生互作,说明StPI 143、StPI 146除直接作用于蛋白酶调控蛋白质的降解外,还可能通过参与蛋白质泛素化的过程来影响蛋白质的降解,减少游离氨基酸的积累,进而影响马铃薯的酶促褐变。