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目的采用干燥综合征患者颌下腺细胞为研究对象,以益气养阴祛瘀方为主要依托,初步探索与干燥综合征相关蛋白通道的调控机制,为临床治疗SS提供更广泛的思路。方法1、不同浓度比例的益气养阴祛瘀方对SS患者颌下腺细胞AQP5和M3R蛋白表达的影响:①通过SD大鼠制备益气养阴祛瘀方含药血清,以取得的血清培养SS患者颌下腺细胞,设置5%的含药血清组、10%的含药血清组、15%的含药血清组、20%的含药血清组、30%的含药血清组、空白血清组、无血清组、空白组,共8组。设置5个时间点作为纵向的对照,以CCK-8法检测不同浓度比例的益气养阴祛瘀方含药血清对SS患者颌下腺细胞活性的影响。②分别设置如下组:空白组(仅含RPMI1640培养液),10%空白血清+RPMI1640组,和分别设定给予含5%、10%、15%、20%不同浓度比的含药血清+RPMI1640培养液组,共6组,培养细胞24h后,Westem-blot法检测细胞中AQP5及M3R蛋白表达的水平。③设置空白血清组、5%含药血清组、10%含药血清组、30%含药血清组共四组,以激光共聚焦显微镜观察。2、益气养阴祛瘀方、IFN-γ、IFN-γ拮抗剂对SS患者颌下腺细胞AQP5、M3R、Flotillin-2等表达的影响:将培养的细胞设置为六个组,分别给予以下处理:空白组(仅含RPMI1640培养液),空白血清组(含10%的空白血清+RPMI1640培养液),含药血清组(10%的益气养阴祛瘀方含药血清+RPMI1640培养液),IFN-γ组(IFN-γ+RPMI 1640 培养液),IFN-γ+IFN-γ 拮抗剂组(IFN-γ+IFN-γ 拮抗剂+RPMI1640培养液),IFN-y+10%益气养阴祛瘀方含药血清组(IFN-y+10%益气养阴祛瘀方含药血清+RPMI1640培养液),共六组,培养细胞24h。①Westem-blot法检测颌下腺细胞中AQP5和M3R蛋白的表达。②RT-PCR法检测颌下腺细胞中AQP5 mRNA和M3R mRNA的表达。③激光共聚焦显微镜观察SS患者颌下腺细胞AQP5、Flotillin-2蛋白表达的变化。结果1、不同浓度比例的益气养阴祛瘀方对SS患者颌下腺细胞AQP5和M3R表达的影响。①细胞活性(OD值)测定:培养12h的细胞,10%血清组OD值大于空白血清组和无血清组,(P<0.05),差异有统计学意义;培养24h的细胞,10%、15%、20%、30%含药血清组的OD值均大于无血清组的,且10%、15%含药血清组的OD值大于空白血清组,(P<0.05),差异有统计学意义;培养36h的细胞,10%、15%、20%、30%的含药血清组OD值均大于无血清组,其中10%、15%、20%的含药血清组还比空白血清组的OD值大,(P＜0.05),差异有统计学意义;但30%的含药血清组与空白血清组相比,(P>0.05),差异无统计学意义;培养48h的细胞,10%、15%、20%、30%的含药血清组OD值亦大于无血清组,但20%、30%的含药血清组与空白血清组相比差异不大,(P>0.05),差异无统计学意义;培养72h的细胞,10%、15%的含药血清组均大于无血清组,亦大于空白血清组,(P<0.05),差异有统计学意义。②AQP5、M3R蛋白表达测定:5%含药血清组高于空白组AQP5蛋白表达,10%含药血清组高于5%血清组AQP5蛋白表达,15%含药血清组高于空白组,并且高于5%、10%含药血清组(P<0.05),差异有统计学意义;同样M3R蛋白的表达趋势与AQP5一致,15%含药血清组分别高于10%、5%含药血清组和空白血清组(P<0.05),差异有统计学意义,但与20%含药血清组差异不大(P>0.05),无统计学意义。③激光共聚焦显微镜观察:细胞内AQP5、M3R荧光强度增强,10%含药血清组所标记的AQP5明显高于空白血清组、5%、30%的血清组;5%的含药血清组M3R表达高于空白血清组,但弱于10%的含药血清组。2、益气养阴祛瘀方、IFN-y、IFN-γ拮抗剂对干燥综合征颌下腺细胞AQP5、M3R、flotillin-2等表达的影响。①AQP5、M3R蛋白表达:Westem-blot法检测到IFN-γ组的AQP5、M3R蛋白表达明显下降,低于IFN-γ+拮抗剂组及干扰素+益气养阴祛瘀方组(P＜0.05),后两者比较(P＞0.05),差异无统计学意义。②AQP5 mRNA、M3R mRNA表达:RT-PCR法检测到IFN-Y+拮抗剂组AQP5mRNA、M3R mRNA表达结果大于IFN-γ组,且与IFN-γ加益气养阴祛瘀组差异不大(P>0.05),差异无统计学意义;同样,IFN-γ+益气养阴祛瘀方组AQP5 mRNA、M3R mRNA表达结果大于IFN-γ组(P<0.05),差异有统计学意义。③激光共聚焦显微镜观察:益气养阴祛瘀方干预细胞后所标记的AQP5蛋白荧光表达强度增加;经过IFN-γ处理颌下腺细胞后,可见细胞中AQP5的荧光强度明显降低,IFN-Y+拮抗剂组比IFN-γ组AQP5的荧光强度高,且AQP5的表达位置发生改变。结论益气养阴祛瘀方具有调节SS患者颌下腺细胞中水通道蛋白AQP5分布和调节M3R表达的作用,从而控制唾液腺中的水分转运。在IFN-γ的刺激下,颌下腺细胞中的AQP5的表达量大大下降,所以这很可能是诱导SS发病的重要因素之一。IFN-γ拮抗剂和益气养阴祛瘀方能有效阻止IFN-γ导致的颌下腺细胞中的AQP5位置异常分布,保持水运正常,可作为治疗SS一个重要依据。