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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起猪繁殖与呼吸障碍的高度传染性疾病,俗称“猪蓝耳病”。2006年暴发的猪“高热病”给中国养猪业造成灾难性打击,其主要病原为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。现有的疫苗和生物安全措施并不能很好地控制猪“高热病”的流行,从遗传本质上提高猪抗病性能是未来重要的方向之一。我国地方猪种资源丰富,但对其PRRSV抗性或者易感性的研究尚未见报道。本研究首先建立了猪PRRSV易感性体外评价方法,在此基础上对江苏、安徽省部分猪品种开展PRRSV易感性的评价,研究猪PRRSV易感性与免疫相关因子的关联性,为猪PRRSV抗性育种奠定种质资源与选育方法的基础,以促进我国地方猪种资源的保护和创新利用。主要实验内容包括如下四部分:第一部分:PRRSV NJGC株的仔猪回归试验为了给PRRSV易感性评价提供合格的毒株,本研究对PRRSV NJGC株进行动物回归试验,证实了 PRRSV NJGC株的毒力与感染发病规律。结果如下:攻毒Id后,猪只体温开始升高,8d后达到最高峰40.9～42.3℃,出现嗜睡、呼吸困难,食欲下降、拉稀、消瘦,全身发红、耳朵发蓝紫色,伴有肌肉震颤等蓝耳病典型症状,并于感染后11～13天5只仔猪全部死亡。死亡猪只肺部呈间质性和出血性肺炎,有较大面积暗紫色肉样病变伴有坏死灶;肝脏淤血明显,肝脏细胞出现坏死、崩解,肝小叶内出现大小不等的灰白色结节;脾脏肿胀,有大量针尖状出血点;肾脏稍微肿大,点状和针尖状出血;淋巴结特别是腹股沟淋巴结、肺门淋巴结肿大、出血、坏死;肠道充血、出血、溃疡。RT-PCR检测到病死猪只心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结组织中均有病毒RNA的存在。表明PRRSV NJGC株毒力较强,这为下一步研究PRRSV NJGC体外感染PAM奠定了重要的基础。第二部分:基于PAM中PRRSV复制差异的猪PRRSV易感性评价模型的建立为了建立猪对PRRSV易感性评价的模型,本实验开展了 PRRSV NJGC株在原代巨噬细胞(Porcine Alveolar Macrophages,PAM)中增殖规律的研究。将PRRSV NJGC株接种于分离纯化后的PAM,采用荧光定量PCR方法检测接毒后4、8、12、18、24、32、36、48、60和72h PAM中PRRSV的复制情况,并同时测定PAM上清液中PRRSV滴度。结果表明..PRRSV体外感染PAM 4h病毒开始增殖,8～12hPRRSVmRNA积累量迅速上升,并在12h达到最高,在12～18h迅速下降,24hPRRSVmRNA积累量下降到较低水平,然后继续缓慢下降直至72h。PAM上清液病毒滴度6～12h迅速上升,12～24h为平台期,随后转入衰亡期。结合PAM中PRRSV复制和PAM培养上清病毒滴度变化规律,猪对PRRSV易感性评价模型以接毒后6、12、18、24和36h作为评价的时间点,以PAM中PRRSV mRNA丰度和上清液病毒滴度作为评价指标。第三部分:苏皖部分猪品种PRRSV易感性的评价为比较苏皖部分猪品种对PRRSV易感性的差异,本研究分离并纯化二花脸、梅山猪、苏钟猪、姜曲海与定远猪肺泡巨噬细胞,体外感染PRRSV NJGC株,采用荧光定量PCR方法检测不同时间点、不同品种PAM中PRRSV的复制情况,同时测定PRRSV感染后PAM培养上清中PRRSV的滴度。结果表明,PRRSV在不同品种猪PAM中复制的累积规律相同,均在12h病毒载量达到高峰,12～18h迅速下降。各品种PAM培养上清中病毒滴度变化规律相似,6～12h滴度上升,12～24h为平台期。对二花脸、梅山猪、苏钟猪、姜曲海与定远猪进行蓝耳病毒易感性的比较表明,姜曲海猪是蓝耳病毒相对低易感的品种,而苏钟猪与定远猪为相对高易感的品种。姜曲海猪对蓝耳病毒的易感性显著(P<0.055)低于于定远猪与苏钟猪(12h)。这为进一步开展猪蓝耳病抗性育种奠定了种质资源的基础。第四部分:不同猪种PAM感染PRRSV前后细胞因子、PRRSV受体Sn、Toll样受体3的表达为探索PAM中细胞因子、PRRSV受体、Toll样受体3与猪对蓝耳病易感性的关联,本实验采用荧光定量PCR对不同品种猪PAM感染PRRSV前后TH2型代表性细胞因子IL-8、IL-10,TH1型代表性细胞因子TNF-αIFN-γ,蓝耳病受体Sn及Toll样受体3表达情况进行了测定。结果表明:各品种猪感染PRRSV后IL-8、IL-10表达量上升,而TNF-α表达量降低;各品种IL-10表达量由高到低依次为:定远猪、姜曲海猪、梅山猪、二花脸、苏钟猪;IL-8表达量由低到高依次为:定远猪、姜曲海猪、梅山猪、二花脸、苏钟猪;TNF-α表达量由低到高依次为:定远猪、姜曲海猪、梅山猪、苏钟猪、二花脸。这些结果表明,PRRSV能够诱导IL-10、IL-8的表达,抑制TNF-α的表达,且IL-10、IL-8、TNF-α表达在一定范围内可以抑制PRRSV在PAM中的复制,当IL-10表达过高、IL-8和TNF-α表达过低时反而促进PRRSV在PAM中的复制,同时高水平的IL-10表达可能抑制IL-8、TNF-α的表达。PRRSV体外感染PAM后各品种IFN-y mRNA表达量呈上调趋势,易感性最低的姜曲海猪表达量最高,易感性相对较弱的梅山猪表达量次之,高易感性的苏钟猪表达量最低,其中12、24和36h梅山猪均显著高于苏钟猪与定远猪(P<0.05)。提示PRRSV能够诱导IFN-γ的表达,而高表达的IFN-γ可能抑制PRRSV在PAM中的复制。PRRSV体外感染PAM后,Sn与TLR3 mRNA表达量随着感染时间的增加均呈上升趋势,低易感性的姜曲海猪Sn与TLR3表达量均低于其它四个品种,其中TLR3 12h表达量的差异达到极显著水平(P<0.01)。这些结果提示PRRSV可以诱导Sn与TLR3的表达,Sn的高表达可能与猪对PRRSV的易感性相关。