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真菌耐药现象越来越普遍，虽然以酵母为材料对真菌耐药机制已经进行了比较深入的研究，但在丝状真菌中的耐药机理还不清楚。本课题以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)为材料，研究丝状真菌对唑类药物的耐药机制。本研究分为两个部分：
第一部分是从药物外排方面，通过BLASTp比对搜索发现粗糙脉孢菌中存在4个Pdr5p的同源蛋白：CDR4、ATRF、ATRF2和ATRB。对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、粗糙脉孢菌以及其它多种丝状真菌中的Pdr5p同源蛋白进行系统进化分析，发现在所选的丝状真菌中存在两个类群的Pdr5p同源蛋白，CDR4和指状青霉(Penicillium digitarum)中的PMR1分布在-个类群，ATRF、ATRF2、ATRB和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中的AtrB、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的AtrF分布在另一个类群。利用酮康唑(ketoconazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、苯菌灵(benomyl)和两性霉素B(amphotericin B)对cdr4、atrf.atrf-2和atrb基因缺失菌株进行药物敏感性测试实验，发现只有cdr4基因缺失菌株增加了对唑类药物的敏感性。通过杂交获得了atrf：atrf-2和atrb三基因缺失菌株，该菌株对上述各种药物仍然没有表现出比野生菌株有更高的敏感性。并且通过荧光定量PCR检测酮康唑处理前后野生菌株中cdr4、atrf、atrf-2和atrb基因的转录水平，发现只有cdr4的转录水平明显升高，而atrf、atrf-2和atrb的转录水平基本不变。以上实验结果结合前人已有的研究说明，相对于AtrB和AtrF，丝状真菌中PMR1所在类群的Pdr5p同源蛋白在应对唑类药物胁迫的过程中发挥更加重要的作用。
第二部分是从转录调控方面，首先在粗糙脉孢菌中找到139个转录因子的编码基因，然后利用酮康唑分别对这些转录因子编码基因的敲除菌株进行药物敏感性测试实验，从中筛选到一个转录因子编码基因的敲除菌株，在加有酮康唑的药物平板上，该菌株具有比野生菌株更加敏感的表型。又利用氟康唑和伊曲康唑对该敲除菌株进行药物敏感性测试实验，结果表明该敲除菌株对这些药物的敏感性也高于野生型。而在高温(40℃)、高渗透压力(1 M NaCl)和高氧化压力(18μg/mlmenadione)条件下，该敲除菌株并没有表现出比野生型菌株更加敏感的表型。因此，我们将该转录因子的编码基因命名为ads-1(antifungal drug sensitive-1)。ads-1回补菌株对酮康唑、氟康唑和伊曲康唑的敏感性回复到了野生菌株的水平，进一步证明ADS-1参与粗糙脉孢菌对唑类药物的耐药调控作用。ADS-1的同源蛋白在丝状真菌中普遍存在，串珠镰刀菌(Fusarium veticilliodes)中的ADS-1同源蛋白FvADS-1编码基因的敲除，也增加了该菌对酮康唑的敏感性，说明该蛋白功能相对保守。为分析ADS-1对耐药性的调控机制，我们分别对酮康唑处理前后的野生菌株和ads-1敲除菌株的RNA样品进行了DGE测序分析，DGE结果显示2058个基因在酮康唑的诱导下增加或减少了转录，其中ads-1的转录水平增加了6.8倍。根据RNA样品的DGE测序结果，ADS-1参与调控酮康唑胁迫下1160个基因的转录变化，其中cdr4与两新发现的基因ads-2和ads-3对唑类药物的耐受性具有重要贡献。