西瓜银斑驳病毒的分子特性及抗血清的制备

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dingmx2008
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番茄斑萎病毒属(Tospovirus)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)中唯一能侵染植物的属,该属病毒由蓟马以持久方式传播,寄主范围广泛,严重危害多种经济作物,其代表种番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)已成为全世界10种危害最大的植物病毒之一,是我国进境植物检疫的危险性有害生物。西瓜银斑驳病毒(Watermelon silver mottle virus,WSMoV)是番茄斑萎病毒属西瓜银斑驳病毒血清组的病毒,在田间主要危害葫芦科作物。广东的气候条件有利于介体蓟马和WSMoV的发生,因此,有必要了解WSMoV的分子生物学特性并建立相应的检测方法,为进一步通过基因工程培育抗病品种以及制定该病毒的防控措施奠定基础。  本研究建立了WSMoV的RT-PCR分子检测体系和间接ELISA检测体系能对该病毒进行快速稳定的检测。另外我们还设计了13对引物,扩增了WSMoV的基因组片段,克隆测序并拼接后获得了WSMoV的基因组全序列,将其命名为WSMoV-GZ。WSMoV-GZ的三条RNA链编码非结构蛋白(NSs)、衣壳蛋白(N)、非结构蛋白(NSm)、病毒糖蛋白的前体蛋白(Gn/Gc)和依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)。将WSMoV-GZ同Genbank上已公布的Tospovirus病毒的基因组全序列比对分析发现:这五种蛋白与其它地区WSMoV分离物的氨基酸序列同源性为94.3%-97.5%、与WSMoV血清组其它病毒的氨基酸序列同源性为61.2%-91.8%,而与其它血清组病毒的氨基酸序列同源率较低。构建的遗传进化树也均表明WSMoV-GZ与WSMoV血清组的亲缘关系最近。基因组全序列长度有所差异,主要差异在基因间隔区(Intergenic region,IGR),这一区域与RNA转录的校正和终止相关,且可能会为WSMoV种群的研究提供依据,基因功能及致病性有待进一步研究。  本研究将WSMoV的N基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了原核表达重组质粒pET28a-CP,并在大肠杆菌Rosseta(DE3)中高效表达了大小为31.4kDa左右的His融合蛋白。可溶性分析表明融合蛋白存在于菌体沉淀中。表达产物通过其N-端的His标签进行纯化,得到高纯度的目的融合蛋白,以其作为抗原免疫健康家兔获得了该蛋白的抗血清。western-blotting分析表明制备的抗血清专化性强,间接ELISA法检测抗血清效价,结果表明抗血清效价达1万倍以上。有较高的应用价值,可用于WSMoV的血清学检测。为将来WSMoV田间调查和病害诊断及流行学研究等奠定了基础。
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