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目的自然杀伤细胞(natural killer cells, NK cells)是天然免疫系统的重要成员之一,在机体抵抗外源病原体感染及清除自身转化细胞中起到重要作用,是免疫防御的前沿哨卡。近年研究发现,NK细胞不仅能对外源感染产生免疫应答,还具有免疫调节作用,能够正向或负向调节其他免疫细胞如T细胞及抗原递呈细胞的功能,参与固有免疫和获得性免疫的调节,维持体内免疫平衡。但至今未找到具有类似于调节性T细胞表型和功能的NK细胞亚群,寻找并确定调节性NK细胞的表型和功能需要进一步深入研究。Foxp3是forkhead转录因子家族的一个成员,特异性表达于调节性T细胞,对调节性T细胞的发育和功能是必要的。此外,Foxp3表达水平与调节性T细胞抑制活动的程度密切相关。人类Foxp3的突变缺失,可导致调节性T细胞缺乏和严重自身免疫反应的发生。大量研究表明,在初始CD4+T细胞中诱导表达Foxp3,或将Foxp3分子用基因转染的方法导入初始T细胞也能诱导同样的免疫调节功能。更为有趣的是,近期的一项研究发现,利用基因转染的方法在树突状细胞(DCs)中表达Foxp3使得DC细胞具有了免疫抑制功能。这些研究成果提示Foxp3发挥功能不仅仅局限于调节性T细胞,在其他免疫细胞中异源表达Foxp3也有可能诱导产生免疫调节功能。至今未发现NK细胞中有Foxp3表达。基于上述研究,我们设想将Foxp3分子导入NK细胞中表达,可研究Foxp3分子的功能并有助于调节性NK细胞的发现。造血干细胞移植已被广泛应用于治疗白血病、淋巴瘤等恶性疾病,但常常伴随发生移植物抗宿主病(GVHD)等副作用。研究发现,NK细胞在避免GVHD反应和增强移植物抗肿瘤(GVT)效应中发挥积极作用,促进移植物的存活、减少疾病的复发。同时,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞也可降低GVHD的发生。如果在NK细胞中表达Foxp3,使其具有免疫抑制功能,将有利于增强NK细胞对GVHD的抑制作用,提高造血干细胞移植的成功率。方法1.电穿孔法将Foxp3表达质粒转染入NKL/NK-92细胞系；2. RT-PCR和Western Blot检测Foxp3在NKL/NK-92中的表达；3.MTT方法检测Foxp3过表达NKL/NK-92细胞的增殖能力；4.MTT方法检测Foxp3过表达NKL/NK-92细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；5.实时定量PCR和流式细胞术检测Foxp3过表达NKL/NK-92细胞表面受体及杀伤相关分子表达；6.酶联免疫吸附法分析Foxp3过表达NKL/NK-92培养上清中IL-10的浓度；7.荧光素酶报告基因实验检测Foxp3对IL-10转录活性的调节；8. Foxp3过表达的NKL细胞和人外周血淋巴细胞(PBMC)共孵育,流式细胞术检测PBMC活化分子CD69表达及细胞增殖；MTT法检测PBMC对肿瘤细胞的杀伤能力。加入IL-10中和抗体,研究NKL.Foxp3细胞分泌的IL-10在抑制PBMC功能中的作用机制。结果1. Foxp3成功转入NKL/NK-92细胞并过表达；2. Foxp3基因修饰的NKL/NK-92细胞增殖活性下降；3. Foxp3基因修饰的NKL/NK-92细胞对肝癌细胞的杀伤能力降低；4. Foxp3基因修饰上调NKL/NK-92细胞表面抑制性受体NKG2A的表达(mRNA水平),蛋白水平没有变化；5. Foxp3基因诱导NKL/NK-92细胞分泌高水平的免疫抑制细胞因子IL-10；6. Foxp3基因增强IL-10转录活性,直接调控IL-10表达；7. Foxp3基因修饰的NKL细胞能够有效抑制PBMC的增殖和活化,其抑制功能依赖于IL-10的分泌。结论Foxp3分子特异性表达在CD4+CD25+调节性T细胞上,是调节性T细胞的关键分子标志,对其分化、发育及发挥生物学活性具有关键作用。有研究发现,在初始CD4+T细胞(naive CD4+T cells)或树突状细胞(DCs)中异源表达Foxp3分子能够诱导产生调节性T细胞的特征和功能。目前尚不清楚在NK细胞中表达Foxp3是否也能诱导出调节性功能。本研究应用电穿孔转染的方法把Foxp3重组质粒(pRV.GFP Foxp3)以及对照质粒(pRV.GFP WWRR)转染入NKL/NK-92细胞系中,发现异源表达Foxp3上调NK细胞表面抑制性受体NKG2A的表达,导致NK细胞对肿瘤细胞杀伤能力的下降；更有趣的是,过表达Foxp3能够诱导NK细胞分泌大量的免疫抑制因子IL-10。进一步研究发现,Foxp3分子在一定程度上能够直接调节IL-10的表达。同时,表达Foxp3的NKL细胞能够负向调节经PMA和离子霉素刺激的PBMC细胞的活化程度和杀伤活性。分泌IL-10的NKL.Foxp3细胞表现出免疫抑制性功能,能够明显抑制CD3+T细胞的活化。用特异性抗体中和IL-10后,NKL.Foxp3细胞对PBMC的抑制作用明显减弱,说明获得的免疫抑制性功能依赖于IL-10的分泌。这是首次发现在NK细胞中异源表达Foxp3能够诱导大量IL-10产生并表现出免疫负调节特征。本研究发现,过表达Foxp3分子后,NK细胞能够分泌IL-10并获得免疫调节性功能。另外,考虑到NK细胞和IL-10在骨髓移植后发生的移植物抗宿主病(GVHD)中都发挥重要的调节作用,Foxp3基因修饰的NK细胞在GVHD或其他自身免疫病治疗中具有潜在的利用价值。