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本论文的目的在于通过分别检测鼻咽癌肿瘤组织EGFR蛋白表达以及鼻咽癌患者相配对的原发灶和颈部淋巴结转移灶的EGFR蛋白表达和KRAS突变，探讨鼻咽癌肿瘤组织EGRR蛋白表达与鼻咽癌患者生存预后的关系以及EGFR蛋白表达和KRAS突变在鼻咽癌原发灶和颈部淋巴结转移灶的差异及临床意义；通过体内外实验，了解EGFR靶向药物Cetuximab联合放疗和顺铂对鼻咽癌细胞株的作用机制，探讨Cetuximab联合放化疗治疗鼻咽癌患者的临床应用前景和价值。
第一章 EGFR在鼻咽癌组织中的表达和临床意义
目的:
采用免疫组化染色的方法检测EGFR蛋白在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达，并分析其与鼻咽癌的临床特征和生存预后的关系，为鼻咽癌的靶向治疗提供初步依据。
方法:
本研究选取1999年1月至12月全年在中山大学肿瘤防治中心放疗科治疗的初治鼻咽癌病例，其中临床和随访资料完整且能在我院病理科获取鼻咽癌组织蜡块标本病例235例。所有患者均病理证实为未分化非角化性癌。用免疫组化方法检测鼻咽癌组织中EGFR蛋白的表达情况，结合患者的临床特征及随访资料，对患者的无瘤生存时间和总生存时间等进行单因素Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox回归分析。结果采用SPSS13.0统计软件进行数据分析和处理。
结果:
235例鼻咽癌患者组织中EGFR阳性表达率为89.4％，阳性表达部位主要在细胞膜。EGFR表达与T分期、N分期相关，而与年龄、性别及临床分期均无关。单因素Kaplan-Meier生存分析表明本组患者中EGFR表达高低不同者，其无复发生存时间、无转移生存时间、无瘤生存时间和总生存时间的差别均无统计学差异；多因素Cox回归分析表明鼻咽癌组织EGFR高表达不是本组患者预后的独立影响因素；
结论:
EGFR在鼻咽癌组织中阳性表达率高达89.4％，提示EGFR有可能作为鼻咽癌靶向治疗的有效靶点。EGFR的表达与鼻咽癌的T分期、N分期相关，而与年龄、性别和临床分期无显著相关，与预后无显著相关。鼻咽癌组织EGFR高表达不是预后的独立影响因素。
第二章 EGFR表达和KRAS突变在鼻咽癌原发灶和颈部淋巴结转移灶的对比研究
目的:
通过分别比较EGFR蛋白表达和KRAS突变在鼻咽癌患者的原发灶和相应颈部淋巴结转移灶中的情况，探讨两者在鼻咽原发灶和转移灶的差异，为临床上靶向药物治疗鼻咽癌提供分子预测的初步依据。
方法:
收集中山大学肿瘤防治中心1997年1月至2003年7月治疗的86例初治并同时进行鼻咽部和颈部淋巴结转移灶活检的鼻咽癌患者。分别检测鼻咽原发灶和相应颈部淋巴结转移灶EGFR蛋白表达和KRAS突变情况，分别比较EGFR蛋白表达和KRAS突变在鼻咽原发灶和颈淋巴结转移灶的情况。双边P<0.05被认为是有统计学意义。应用统计软件SPSS13.0分析数据。
结果:
86例配对的鼻咽癌原发灶和颈部淋巴结转移灶中，EGFR的阳性表达率分别为73.3％和60.5％，两者之间的表达存在显著性差异(p=0.001)；EGFR在原发灶和颈部淋巴结转移灶之间总的变化率为29.1％。86例配对的鼻咽癌原发灶和颈部淋巴结转移灶中，共检测了57例患者的KRAS突变情况，其中12例(21.1％)鼻咽癌原发灶存在KRAS突变，4例(7％)颈部淋巴结转移灶存在KRAS突变，主要是第2外显子13密码子突变，4例患者的原发灶和转移灶同时存在KRAS突变。
结论:
鼻咽癌患者的原发灶和颈淋巴结转移灶均存在不同的EGFR蛋白表达和KRAS基因突变，为进一步研究靶向药物的临床应用筛选分子预测指标提供依据。
第三章 EGFR靶向药物Cetuximab联合照射和顺铂对鼻咽癌细胞株作用机制的体外实验研究
目的:
通过体外实验，探讨Cetuximab联合照射和细胞毒药物顺铂对鼻咽癌的作用机制和临床价值。
方法:
选择人鼻咽癌细胞株CNE2，MTT法测定Cetuximab、顺铂以及两药联合的细胞毒作用；采用Annexin V-FITC and Propidium Iodide(PI)双染法通过流式细胞仪检测Cetuximab联合照射和顺铂处理后的早期细胞调亡和细胞周期情况；提取用Cetuximab联合照射和顺铂处理后的细胞总蛋白，用免疫印迹的方法分析PI3K/Akt信号通路的关键酶Akt、p-Akt(Ser473)，MEK/MAPK信号通路的关键酶ERK1/2、p-ERK1/2蛋白以及凋亡死亡底物PRAP的表达情况。
结果:
Cetuximab对鼻咽癌细胞株CNE2的生长有一定的抑制作用。Cetuximab联合顺铂作用后，抑制鼻咽癌细胞生长的作用增强。Western blot分析结果示，照射、细胞毒药物顺铂对EGFR、AKT、ERK1/2、p-AKT和p-ERK1/2蛋白水平影响不明显，Cetuximab无论单用或联合顺铂和或照射应用对CNE2细胞株的p-EGFR、p-AKT、p-ERK1/2蛋白水平均有下调作用，而对EGFR、AKT和ERK1/2的总量影响不大。与单用Cetuximab相比，Cetuximab联合照射或顺铂可以进一步下调p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2蛋白的表达，以作用48h后更明显。而Cetuximab联合照射和顺铂几乎完全抑制p-EGFR、p-AKT和p-ERK1/2的表达。
结论:
单药Cetuximab在体外对CNE2细胞株的增殖都具有一定的抑制作用，联合顺铂抑制作用增强显。单药Cetuximab能诱导CNE2细胞发生凋亡，联合照射和细胞毒药顺铂作用，诱导CNE2细胞株细胞凋亡的作用更强。Cetuximab可抑制胞内信号传导相关的AKT及ERK通路，Cetuximab联合照射和顺铂可导致胞内相关信号传导通路产生更明显抑制。
第四章 Cetuximab联合照射和顺铂对人鼻咽癌移植瘤荷瘤裸鼠模型作用的研究
目的:
观察Cetuximab单用和或联合照射及顺铂对鼻咽癌荷瘤裸鼠移植瘤生长有无抑制作用，以及裸鼠对Cetuximab联合照射和或顺铂的耐受性，探讨Cetuximab联合照射和细胞毒药物顺铂在体内对鼻咽癌细胞生长的影响和治疗价值，为临床研究提供实验依据。
方法:
用CNE2细胞在裸鼠身上建立鼻咽癌移植瘤模型，移植瘤荷瘤裸鼠总共80只，随机分为8组，分别为对照组、单纯照射组，单药Cetuximab治疗组，Cetuximab联合照射治疗组，单药DDP治疗组，DDP联合照射组，Cetuximab联合DDP治疗组，Cetuximab联合照射和DDP治疗组，每组各10只。Cetuximab治疗组每间隔3天用含Cetuximab1 mg的药物原液0.5ml，腹腔内注射，总共给药3次，第一次给药在放疗和DDP注射前6小时给药；DDP治疗组每次用含5mg/kg DDP腹腔内注射，隔天给药，连续给药3次。照射组每天照射2Gy，连续照射6天。期间每周2次用毫米游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长、宽最大垂直直径的大小，记录并计算各组裸鼠治疗前体重和肿瘤体积，治疗后的平均体重和肿瘤体积。结束用药和照射后观察3周后处死动物，取出肿瘤组织，把移植瘤用石蜡包埋以便免疫组化分析。
结果:
治疗前各组裸鼠体重和肿瘤体积均无显著性差异；治疗过程中未观察到明显的裸鼠进食、活动减少和皮疹等不良反应；治疗后各组裸鼠肿瘤体积和重量均较对照组减少，肿瘤生长受到一定的抑制，Cetuximab联合照射和顺铂，能更明显抑制肿瘤的生长，与对照组裸鼠相比具有统计学差异。
结论:
CNE2鼻咽癌细胞荷瘤裸鼠对Cetuximab联合放疗和细胞毒药物顺铂治疗的耐受性较好；Cetuximab联合照射或顺铂对CNE2细胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，三者联合能明显抑制肿瘤生长，但Cetuximab与DDP和/或照射合用未能显著增强DDP和/或照射联合对CNE2细胞裸鼠移植瘤模型的效果。
结论:
1.EGFR在鼻咽癌组织中高表达，与T分期和N分期相关，而与年龄、性别和临床分期无关。
2.EGFR的表达与鼻咽癌的预后无明显相关，EGFR高表达不是鼻咽癌预后的独立影响因素。
3.EGFR蛋白表达和KRAS突变鼻咽癌原发病灶和转移病灶之间存在差异。鼻咽癌KRAS突变主要是第2外显子13号密码子。
4.Cetuximab单药能抑制CNE2的增殖，但抑制作用并不明显，联合顺铂作用，其抑制强度增加，具有协同效应。
5.Cetuximab可诱导CNE2细胞凋亡，联合照射和顺铂，其诱导细胞凋亡的作用更明显。
6.Cetuximab可抑制p-EGFR的活化而导致胞内信号传导AKT及ERK通路的抑制，联合照射和顺铂作用，其抑制通路分子的作用更明显。
7.CNE2细胞荷瘤裸鼠对Cetuximab联合照射和顺铂治疗的耐受性较好。
8.Cetuximab联合照射或顺铂对CNE2细胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，三者联合能明显抑制肿瘤生长，但Cetuximab与DDP和/或照射合用未能显著增强DDP和/或照射联合对CNE2细胞裸鼠移植瘤模型的效果。