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目的肺炎克雷伯菌（K.peneumoniae,Kpn）的耐药性逐年增强与临床上各种疗效高、抗菌谱广的抗菌药物被广泛使用息息相关。本课题根据突变选择窗（Mutant selection window,MSW）理论,结合文献,选择阿米卡星（Amikacin,AK）、比阿培南（Biapenem,BIA）、左氧氟沙星（Levofloxacin,LEV）、哌拉西林/他唑巴坦（Piperacillin/tazobactam,TZP）4种临床常用抗Kpn感染的抗菌药物五种二联组合进行研究,以达到以下目的:1、测定受试菌株对应于AK、BIA、LEV和TZP单用及和不同二联组合联用时的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration,MIC）及防耐药突变浓度（Mutant prevention concentration,MPC）,探讨MSW在药物单用和联用时的变化,评价不同组合的抗菌药物对Kpn的体外抗菌活性,以便于临床参考,帮助Kpn感染制定合理抗菌药物联合方案。2、研究Kpn突变菌株对体外杀菌效果最佳药物组合的耐药机制,对耐药突变体的分子耐药机制和基因突变情况在基因层面上进行分析,以期为临床治疗和预防Kpn感染提供依据。方法1、通过纸片扩散法测量抑菌圈直径,分析受试菌株对临床常用的15种抗菌药物的敏感度,由此完成对保存的CRKP菌株复核和筛选。药敏结果按照2016版美国临床实验室标准化研究所（CLSI）标准推荐的方法由抑菌圈直径大小判断:S（敏感）、I（中介）、和R（耐药）。联合用药的药敏结果根据两种药敏纸片抑菌圈的形状判定,以确定联合用药组合。2、肉汤微量稀释法使96孔细菌培养板每孔中药物浓度呈梯度排列,测定受试菌株对应于AK、BIA、LEV和TZP单用和不同二联组合时的MIC,计算出对应的部分抑菌浓度指数（Fractional inhibitory concentration,FIC）。3、肉汤法增菌,使Kpn菌株浓度超过3×1010 CFU·mL-1后依次接种到药物浓度由低到高顺序排列的无菌琼脂板上。测定受试菌对应于AK、BIA、LEV和TZP单用和不同二联组合时的MPC,计算出对应的选择指数（Selection index,SI）。4、通过PCR扩增和DNA测序法分析Kpn耐药菌株对左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦单用及联用的耐药机制。结果1、AK、BIA、LEV和TZP单用对ATCC700603肺炎克雷伯标准菌株ATCC700603的最低抑菌浓度分别为:0.5μg·mL-1、0.125μg·mL-1、0.5μg·mL-1、8μg·mL-1;与单独用药相比,联用后各药的MIC、MPC数值明显下降,均呈现出协同作用。2、AK联合BIA、TZP时对36株临床ESBLs阳性CRKP菌株的MIC范围分别为:0.1254μg·mL-1、0.06258μg·mL-1;在与AK联合时,BIA的MIC范围为18μg·mL-1,TZP的MIC范围为16512μg·mL-1;LEV联合AK、BIA、TZP时对36株临床ESBLs阳性CRKP菌株的MIC范围分别为:0.2532μg·mL-1、0.2564μg·mL-1、0.2532μg·mL-1;在与LEV联合时AK的MIC范围为0.06258μg·mL-1,BIA的MIC范围为0.516μg·mL-1,TZP的MIC范围为8256μg·mL-1。AK分别联合BIA、TZP时对36株临床ESBLs阳性CRKP主要表现协同作用及相加作用,其中协同抗菌作用分别占47.2%（17/36）、36.1%（13/36）;相加作用分别占33.3%（12/36）、27.8%（10/36）;无关作用分别占19.5%（7/36）、36.1%（13/36）,均无拮抗作用;LEV分别联合AK、BIA、TZP时对36株临床ESBLs阳性CRKP主要表现协同和相加作用,其中协同抗菌作用分别占36.1%（13/36）、38.9%（14/36）、44.4%（16/36）;相加作用分别占30.6%（11/36）、27.8%（10/36）、33.4%（12/36）;无关作用分别占33.3%（12/36）、33.3%（12/36）、22.2%（8/36）,均无拮抗作用。3、ATCC700603标准菌株及产生的突变菌经PCR扩增后测序,只有单独使用TZP产生的突变耐药菌株在800 bp附近区域凝胶中有明亮条带,携带bla CTX-M基因;ESBLs阳性CRKP耐药突变菌株中检出2种以上基因的比率分别为:47.2%（LEV单用）、25%（TZP单用）和22.3%（LEV+TZP）。4、测序结果显示,检出携带有bla KPC-2、bla CTX-M-1、bla CTX-M-2基因菌株的序列分别与相应菌株（即JQ838154.1、MG948566.1、KJ803939.1）比对,结果是100%同源所占的比例分别为:89.7%（44/49）、82.6%（19/23）、81.8%（18/22）,其余核苷酸序列中共检出了4种不同的点突变:检出2种blaKPC-2基因序列的突变类型;bla CTX-M-1、bla CTX-M-2基因序列的突变类型各有1种。结论AK与BIA、LEV和TZP之间五种不同抗菌药物二联组合对Kpn的抗菌活性在体外药敏试验中主要以协同作用为主,其次是相加作用。抗菌药物联合用药与单用相比,肺炎克雷伯菌的MIC、MPC数值均显著减少,突变菌株的耐药基因突变率亦显著降低,与此同时,MSW在抗菌药物联合用药时明显地变窄,达到了有效避免耐药突变菌株产生的预期效果。本课题中虽然出现部分菌株在用药后产生多种氨基酸突变的新的亚型,与单独用药相比,抗菌药物联用能够降低突变菌株的发生率。总之,抗菌药物的联合用药应该引起临床药学人员和临床医生们的重视。