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1.研究背景在我国膀胱肿瘤是发病率最高的泌尿系肿瘤疾病。大约在150年前,Virchow提出了炎症是肿瘤发生的易感因素的假设。这个观点来源于他所观察到的现象:癌变组织常常在局部引起慢性炎症反应的发生,炎症细胞也常存在于被切除的肿瘤组织中。1970年,Burnet提出了免疫监视理论:免疫系统能够自发地鉴别肿瘤细胞并将其清除,发挥保护机体组织、对抗肿瘤发展的效应。在过去的10余年的流行病学调查结果显示:易患慢性炎症疾病的患者有较高的患癌风险;在世界范围内约有15%20%的癌症死亡与感染和炎症有关,这个调查结果在一定程度上支持了Virchow的观点。虽然有关免疫系统对癌症的作用:抑癌或促癌特征的研究都有报道,但总的来讲,大量数据显示肿瘤微环境中的免疫反应过程更倾向于促进肿瘤生长、进展,肿瘤微环境产生的免疫抑制作用远大于免疫系统应发挥的有效抗肿瘤作用。肿瘤相关炎症的分子机制的面纱正在逐渐揭开,但还未完全清楚,确定目标分子是提高肿瘤诊断和治疗的关键。肿瘤微环境中存在不同亚群的免疫效应细胞和免疫调节细胞,这一事实证明了肿瘤免疫环境的复杂性。肿瘤诱导的免疫细胞分化和功能的改变使这个独特的环境更加复杂多变。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是一群特殊的细胞,DCs是连接固有免疫反应和适应性免疫反应的桥梁:捕获外来抗原、迁移至淋巴器官、递呈抗原至适应性免疫细胞。DCs是目前发现的诱导初始免疫反应的最有效的抗原递呈细胞,也是具有异质性的细胞群体。它是具有不同表型和功能的亚群,在特定的环境中表现出促肿瘤或抑肿瘤的作用。DCs在抗肿瘤免疫的启动和维持中发挥关键作用,但是在肿瘤微环境中,DCs所具有的强大抗原递呈功能效率明显降低或失效。虽然对于DCs在肿瘤微环境中功能及效率低下的相关研究很多,也提出了涉及功能异常的各种信号通路和相关异常因素的可能性,但目前仍没有可行的治疗方式预防或逆转肿瘤患者DC的功能异常。进一步深入理解肿瘤环境中的DC免疫学是改善肿瘤浸润性DC功能相关治疗方法的关键。IL-23是重要的促炎细胞因子,主要由DCs分泌。目前为止IL-23在肿瘤微环境中的作用仍有争议,IL-23是STAT3调控基因,也是STAT3激动剂。值得注意的是,在肿瘤细胞中STAT3持续活化可以传播到周围环境,并激活一系列的促肿瘤反应。细胞应激或细胞死亡会诱导肿瘤细胞相关的炎症介质如IL-6、ATP、前列腺素（prostaglandin,PG） E2、热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）活化释放入肿瘤微环境中,并促进DC分泌IL-23。有趣的是,PGE2能够下调LPS刺激的单核细胞分泌IL-12。ATP活化DC的P2X嘌呤受体7（P2X purinoreceptor 7,P2RX7）受体,导致NDO样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor pyrin domain-containing3,NLRP3）炎性小体活化,并分泌IL-1β。因此,很有可能是DC或巨噬细胞分泌IL-23、IL-6及NLRP3相关IL-1β促进Th17细胞的分化,诱导以分泌IL-17为主的免疫反应,而不是促进抗肿瘤的Th1型免疫反应。就此而言,危险信号诱导的NLRP3活化以及肿瘤免疫中IL-23的作用都是值得进一步研究的。因此,我们对DC/IL-23在人膀胱尿路上皮癌中的表达及分布特征,以及IL-23对膀胱尿路上皮癌细胞的生物学作用进行研究。2.DC/IL-23在人膀胱尿路上皮肿瘤中的分布特征2.1研究目的:DC细胞亚群、IL-23在人膀胱尿路上皮癌中的分布特征。2.2研究方法:通过免疫组化、Real-time PCR技术检测人膀胱尿路上皮癌组织中DC细胞亚群、IL-23、IL-6、IL-17的分布特征,通过生物信息学分析进一步验证IL-23A在膀胱肿瘤组织中的表达特征和临床意义。2.3研究结果:2.3.1对照组中只存在CD1a+、CD11c+、CD209+未成熟DCs亚群,而CD123+p DCs和CD83+成熟DCs亚群几乎完全缺失;2.3.2在膀胱肿瘤组织中CD11c+、IL-23p19+m DCs、CD123+p DCs以及CD1a+,CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs数量显著增多;2.3.3与非肌层浸润性膀胱肿瘤组比较,肌层浸润性膀胱肿瘤组织中CD11c+,CD123+,CD1a+,CD209+DCs数量显著增多,而CD83+DCs数量有减少趋势;2.3.4与癌旁组织比较,IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在人膀胱尿路上皮癌组织中表达显著增高;2.3.5与正常膀胱组织比较,非肌层浸润性尿路上皮癌癌旁组织IL-23A的表达水平无显著增高,但在癌组织和肌层浸润性尿路上皮癌癌旁组织表达水平显著增高;2.3.6与对应的癌旁组织比较,非肌层浸润性尿路上皮癌组织中的表达水平显著增高,肌层浸润性尿路上皮癌组比较无显著差异。2.3.7与Grade2比较,IL-23A在Grade3膀胱尿路上皮癌组织中的表达显著增高。2.3.8 Kaplan-Meier分析提示IL-23A在临床组织样本中的表达与患者预后呈负相关趋势。2.4研究结论2.4.1生理状态下,DC在组织中主要以未成熟状态存在并维持自身免疫耐受;肿瘤微环境中,大量免疫细胞及炎性细胞浸润,但功能失调;肿瘤恶性程度越高,能够激活肿瘤特异性免疫反应的CD83+成熟DC数量越少,与肿瘤微环境中DC失能以及肿瘤细胞的免疫逃逸机制有关。2.4.2 IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在肿瘤组织中表达显著升高;IL-23A表达水平与肿瘤分级呈正相关,与患者预后有负相关趋势。随着肿瘤恶性程度增高,癌旁组织中IL-23的表达水平有增加趋势,比正常膀胱组织显著增高,这可能是促进膀胱肿瘤进展和复发的一个重要因素。因此,DC亚群、IL-23在膀胱肿瘤组织中的表达与肿瘤的分级具有显著正相关性,与患者预后有负相关趋势,这可能与膀胱肿瘤的高复发和免疫逃逸机制有关。3.不同浓度IL-23对膀胱尿路上皮癌细胞生物学行为的影响3.1研究目的IL-23对膀胱尿路上皮癌细胞的生物学作用。3.2研究方法使用不同浓度IL-23作用于膀胱肿瘤细胞,观察对其增殖、迁移、侵袭的影响。3.3研究结果3.3.1低浓度IL-23（20ng/ml）促进T24尿路上皮癌细胞增殖、迁移、侵袭,并上调增殖相关蛋白Ki67、PCNA表达;高浓度IL-23（40ng/ml）则发挥抑制作用。3.3.2低浓度IL-23（20ng/ml）诱导HUVEC血管生成,而高浓度IL-23（40ng/ml）则发挥抑制作用。3.4结论3.4.1 IL-23以浓度依赖性方式调节T24细胞增殖和EMT变化。3.4.2 IL-23以浓度依赖性方式调节HUVEC血管生成。4.IL-23调节T24细胞EMT转化的机制研究4.1研究目的miR-200b-3p在IL-23调节T24细胞EMT转化中的作用。4.2研究方法4.2.1观察IL-23作用下T24细胞迁移、EMT相关蛋白的变化。4.2.2根据文献报道和Real-time PCR验证,选择具有显著相关性的mi R-200b-3p,观察不同浓度IL-23对过表达mi R-200b-3p T24细胞EMT转化的作用。4.3研究结果4.3.1 IL-23 20ng/ml上调T24细胞间质细胞标记N-钙粘蛋白、OB-钙粘蛋白、Vimentin表达水平,下调上皮细胞标记E-钙粘蛋白表达水平;IL-23 40ng/ml作用则相反。4.3.2过表达mi R-200-3p能够抑制20ng/ml IL-23诱导的促T24细胞增殖、迁移作用,并抑制IL-23诱导的N-钙粘蛋白、OB-钙粘蛋白、Vimentin表达上调,逆转20ng/ml IL-23诱导的E-钙粘蛋白表达下调。4.4结论IL-23作用于mi RNA200b-3p以浓度依赖性方式调节T24细胞增殖、迁移和EMT表型特征。5.全文总结5.1 DC在非肿瘤组织中主要以CD1a+、CD11c+、CD209+DCs亚群存在;肿瘤微环境中CD11c+IL-23p19+m DCs、CD123+p DCs以及CD1a+,CD209+未成熟DCs和CD83+成熟DCs显著增多;肿瘤恶性程度越高,CD83+成熟DCs数量越少。可能的机制有:生理状态下,DC在组织中主要以未成熟状态存在并维持自身免疫耐受;肿瘤微环境中大量免疫细胞及炎性细胞浸润,但功能失调;肿瘤恶性程度越高,能够激活肿瘤特异性免疫反应的CD83+成熟DCs数量越少,与肿瘤微环境中DC失能以及肿瘤细胞的免疫逃逸机制有关。5.2 IL-23、IL-23R、IL-17、IL-6在肿瘤组织中表达显著升高,IL-23A表达水平与肿瘤分级、分期呈正相关,与患者预后有负相关趋势。随着肿瘤恶性程度增高,癌旁组织中IL-23A的表达水平有增加趋势,比正常膀胱组织显著增高,这可能是促进膀胱肿瘤进展和复发的一个重要因素。5.3 IL-23以浓度依赖性方式调节T24细胞增殖、迁移和EMT表型特征,而这种调节作用受mi RNA200b-3p表达水平的影响。