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众多研究表明中枢兴奋性氨基酸递质系统(excitatory amino acid system,EAAs)在急慢性有机磷中毒、以及急性脑缺血、脑损伤和中毒性脑病以及慢性神经退行性变性疾病如帕金森病、亨廷顿舞蹈病等的病因形成中发挥着重要作用。本实验室已有研究也证明了EAAs在乐果中毒后的神经毒性中的作用不可忽视,NMDA受体通路的拮抗剂MK801能够部分改善乐果引起的SD大鼠学习记忆能力的下降。脑内兴奋性氨基酸递质的合成释放以及消除是个复杂的过程,谷氨酸-谷氨酰胺循环及NMDA受体通路都是脑内EAAs保持平衡的关键环节,因此在整体动物以及细胞水平继续深入探讨乐果染毒后大脑皮层EAAs的变化对阐明有机磷中毒的非胆碱能机制意义重大。此外,虽然众多研究都在探讨有机磷农药暴露与某些神经行为疾病之间的联系,但迄今为止,仍缺乏敏感特异的神经生化指标。神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE),胶质酸性纤维蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP)与酸性钙结合蛋白S100β,是脑特异性蛋白,特异的表达于神经元和星形胶质细胞中,近年来常被用作临床急性脑损伤的诊断中,因此也被称为脑损伤相关蛋白。据报道,血清或脑脊液中NSE以及S100β的升高常与疾病的严重程度以及预后高度相关。在本研究中,将从整体动物以及离体细胞模型两个方面来探讨乐果染毒后NSE、GFAP以及S100β作为神经毒性生物标志的可能性,期望为有机磷暴露后可能诱导的神经疾病提供诊断及预后的依据。在大鼠急性有机磷农药中毒模型中,单次灌胃38.9mg/kg·bw,83.7mg/kg·bw和180.0mg/kg·bw的乐果染毒后,与对照组相比,高剂量乐果染毒组中,大脑皮层M1受体亚型mRNA表达的下降以及NMDA受体NR1亚基mRNA表达上升(P<0.01)；皮层NSE、MAP-2(Microtubule-associated protein-2)、GFAP以及S100βmRNA表达的变化与对照组相比并无统计学意义。在大鼠90天乐果中毒模型中,大鼠重复灌胃5mg/kg·bw,10mg/kg·bw或20mg/kg·bw乐果,每周5天,共13周。与对照组相比,大脑皮层低剂量乐果染毒剂量组M1受体mRNA表达下降为对照组的61.2%(P<0.05)；中、高剂量组谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase, GS)活性下降(P<0.01), NR1、NR2B受体mRNA表达上升(P<0.01), NSE mRNA表达上升(P<0.01)；三个剂量组中MAP-2的mRNA表达均上升(P<0.05,P<0.05,P<0.01)；高剂量组GFAP、S100βmRNA表达水平都有显著上升。0.05mg/kg·bw和0.1mg/kg·bw MK801干预后,高剂量干预组NMDA mRNA表达和GS活性较干预前上升(P<0.01),也高于对照组水平(P<0.01)；四个脑特异性蛋白的nRNA表达均下降(P<0.01),且呈剂量依赖趋势。在纯化培养的皮层神经元中,与对照组相比,10-4M乐果染毒48h后EAA(excitatory amino acid)的含量均上升(P<0.01); 10-6M、10-5M及10-4M剂量组细胞内ROS (reactive oxygen species)水平逐渐增高,分别为对照组的2.1,2.28和2.47倍(P<0.01)；凋亡随乐果染毒剂量的增加而增加,Tunel (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling)染色强度分别为对照组的1.18,1.36和1.40倍(P<0.01)；NSE mRNA表达升高,高剂量组为对照组的1.35倍(P<0.01),10-SM及以10-4M组NSE蛋白表达分别为对照组的1.053和1.048倍(P<0.01)。对乐果高剂量组给予50μM和100μM MK801干预后,EAA含量下降(P<0.01)；细胞内ROS水平下降为高剂量乐果染毒组的88.9%和74.8%(P<0.01),但仍远高于对照组细胞内活性氧水平(P<0.01); NR2B mRNA表达上升为干预前的1.59和2.22倍(P<0.01),显著高于对照组水平(P<0.01); NSE mRNA表达下降为干预前的75.7%和732%,有显著性差异(P<0.05,P<0.01),与对照组相比无显著性差异, NSE蛋白表达下降为对照组的73.4%和72.8%(P<0.01),均已降至对照组以下(P<0.01),提示出现神经元的崩解坏死。在纯化培养的皮层星形胶质细胞中,给予10-6M,10-5M,10-4M乐果染毒48h,GS活性、NR2B、GLT-1mRNA表达与对照组相比无显著性差异；GLASTmRNA表达下降为对照组的67.8%、68.6%和76.2%(P<0.05)；高剂量组EAA含量下降(P<0.01); GFAP、S100BmRNA表达及蛋白表达均明显上升(P＜0.01),有剂量依赖趋势。对乐果高剂量组给予50μM和100μM MK801干预后,GLT-1、GLAST mRNA表达水平上升(P<0.01),但与对照组相比无统计学意义；NR2BmRNA表达进一步升高,与未干预前相比没有显著性差异,但均显著高于对照组水平(P<0.05,P<0.01); Glu的含量升高为干预前的1.81倍,有显著性差异(P<0.01)；GFAP转录及蛋白水平下降,但仍然高于对照组表达水平；低剂量干预组S100β蛋白表达与上升,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。采用体外皮层神经元与星形胶质细胞以及少量其他胶质细胞的混合培养模型,给予10-6M,10-5M,10-4M乐果染毒,AChE活性、ChAT活性以及GS活性均下降；EAA的含量均下降(P<0.01)；高剂量组NR2BmRNA表达上升为对照组的1.82倍(P<0.05)；三个剂量组中NSE蛋白表达升高为对照组的1.46,1.60和1.98倍(P<0.01)；高剂量组GFAP、S100B的mRNA表达上升,为对照组的1.97和2.15倍(P<0.05),中高剂量组GFAP及S100B的蛋白表达明显上升(P<0.01)。对乐果高剂量组给予50μM和100μM MK801干预后,高剂量干预组NR2BmRNA表达为干预前的65.5%(P<0.05),Asp和Glu含量上升为干预前的2.35和1.78倍(P<0.01),与对照组相比也有显著性差异(P<0.01)；NSE的蛋白水平下降为干预前的96.2%(P<0.01),远高于对照组水平(P<0.01)；GFAPmRNA表达下降为干预前的48.7%(P<0.05),两个干预组中的GFAP蛋白表达均下降为干预前的88.8%和83.4%(P<0.01,P<0.01),且与对照组相比均无显著性差异；S100BmRNA表达和蛋白表达在两个MK801干预组中均较干预前下降(P<0.01)。以上整体动物实验以及离体细胞模型研究结果提示,乐果作用于EAAs代谢与消除过程有关的酶及NMDA受体来影响中枢EAAs,并造成NSE、GFAP、S100B mRNA和蛋白表达的紊乱,同时整体动物实验表明SD大鼠学习和记忆能力降低。NMDA受体拮抗剂MK801干预后,EAAs的变化大致趋于对照组水平,NSE、GFAP以及S100B的转录及蛋白表达也大致趋于对照组水平,同时整体动物实验表明MK801能够改善SD大鼠的学习和记忆能力。提示中枢EAAs的紊乱是乐果中毒后神经毒性的部分原因；这三个脑特异性蛋白的mRNA表达与SD大鼠学习记忆能力的变化表现一致,能够作为乐果染毒后神经毒性的生物标志；MK801的干预对乐果诱导的神经毒性有积极的作用,但其临床应用还有待进一步研究。