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恶性肿瘤是目前影响人类健康的最主要疾病之一,由于肿瘤发生发展的复杂性,单一治疗方法往往无法满足治疗需求,多种策略联合治疗则应运而生。近年来,化学基因联合治疗成为新的研究热点。化学基因联合治疗可联合不同治疗机制,具有增强肿瘤治疗效果,降低化疗药物的给药剂量,降低毒副作用等优势。然而,由于化疗药物与基因药物理化性质的差异,构建适宜的共递送系统成为两者联合应用的重要挑战之一。有效的共递送载体需要具备化疗药物和基因药物的共装载能力,并且根据联合治疗的需求将化疗药物与基因药物分别靶向递送至各自靶细胞内,从而发挥最优的联合治疗效果。核壳结构的纳米载体具有较强的结构层次性和可控释药特性,在化疗与基因药物共递送载体的研究中显示出巨大的发展潜力和应用前景。为满足化学基因联合治疗的不同给药需求,本课题构建两种核壳结构的纳米载体,采用不同的药物装载方式以实现化疗药物与基因的同一靶细胞共递送(肿瘤细胞)和异靶细胞逐级递送(肿瘤细胞和M2型肿瘤相关巨噬细胞),从而促进了协同治疗效果的发挥。肿瘤细胞共递送载体具备肿瘤微环境酶和pH双重敏感的特征,有利于提高肿瘤细胞共递送靶向性,降低药物的毒副作用。基因与化疗药物异靶细胞共递送载体具有逐级靶向递送的特征,首先将基因与药物共递送至肿瘤组织,再分别递送至各自靶细胞。由于化疗药物与基因共递送载体首次用于异靶细胞共递送,因此对该载体的异靶细胞逐级递送过程进行深入研究,为化疗药物与基因异靶细胞共递送载体的设计和研究奠定基础。此外,将异靶细胞共递送载体用于肿瘤化学免疫联合治疗,探讨共递送策略和混合递送策略在化学免疫联合治疗中抗肿瘤效果及免疫调节效果的差异,为化学免疫联合治疗的载体选择提供依据。本课题主要研究内容及结果如下:第一部分双敏感靶向核壳结构纳米载体共递送多柔比星与质粒DNA至肿瘤细胞的研究第一章设计合成新型载药阳离子聚合物DOX-HBA-PEI(DHP),核磁氢谱和红外图谱确证材料结构,紫外分光光度法测定DHP中DOX载药量为13.90±1.87%(DOX/DHP)。体外释放实验结果显示,在释放48 h时,pH 7.4 PBS中DOX累积释放百分率为30.1±1.4%,而在pH 5.0条件下,48 h后DOX累积释放百分率为66.4±0.5%,显著高于pH 7.4条件下的释放量(p<0.01),DHP具有pH敏感的释药特征。体外细胞毒性实验结果显示,与PEI相比,HP的IC50明显降低(p<0.01),表明对PEI表面氨基进行修饰有利于降低PEI毒性。而DHP在HepG2 和 B16 细胞中的 IC50 分别为 0.12±0.01 μg/mL 和 0.36±0.25 μg/mL,说明化学修饰不影响化疗药物发挥作用。新型载药材料为双敏感靶向共递送纳米载体的组装奠定基础。第二章利用静电吸附作用构建双敏感靶向核壳结构纳米载体。首先通过新型载药材料DHP与DNA静电吸附组装形成共载化疗药物与基因的内核DHP/DNA(DDN),凝胶电泳结果表明,当DHP与DNA质量比大于30:16时可以形成内核。以内核体外转染效率和粒径、电位、PDI作为评价指标,筛选出DDN的最优处方为DHP与DNA质量比为30:4,粒径为77.83±12.96nm,电位为22.6±2.86mV,分散性较好。再将荷正电的内核DDN与荷负电的生物相容性大分子透明质酸(hyaluronic acid,HA)通过静电吸附组装成双敏感靶向共递送纳米载体HA/DDN(HDDN),通过粒径电位考察确定HDDN最优处方为HA与DNA质量比为70:8,粒径为148.3±3.88nm,电位为-18.1±2.03mV,形态圆整。HDDN稳定性好,能避免DNA被酶和血浆成分降解,且具有透明质酸酶敏感的解聚特征。第三章选择CD44受体表达阳性的HepG2和B16细胞系和CD44受体表达阴性的NIH3T3细胞系作为细胞模型,用细胞摄取实验考察HDDN的肿瘤细胞靶向能力,细胞摄取结果表明,在B16和HepG2细胞中DDN与HDDN的细胞摄取率达到70%,但在NIH3T3细胞系中,HDDN的摄取率低于DDN(p<0.05),而且在NIH3T3细胞系中HDDN的摄取率均低于在HepG2细胞和B16细胞,表明HDDN具有肿瘤细胞靶向性,入胞机制研究结果进一步表明HDDN通过CD44受体介导的内吞作用入胞。采用MTT法考察HDDN的体外细胞毒性,在HepG2细胞和B16细胞系中,HDDN的IC50分别为13.88±1.77μg/mL和3.68±0.56μg/mL,HDDN均显示出较好的抗肿瘤效果。在转染剂量下,DDN在无血清转染的转染效率显著高于含血清转染(p<0.05)而HDDN在含血清和无血清条件下转染效率相当(p>0.05),表明HA的修饰能有效保护DNA确保转染效率。HDDN能成功将DOX和pEGFP有效共递送至同一肿瘤细胞内,说明该载体具备共递送化疗药物与基因至同一靶细胞的能力。第二部分异靶点逐级靶向核壳结构纳米载体共递送多柔比星与siRNA用于化学免疫联合治疗的研究第四章为实现异靶点逐级靶向,分别合成肿瘤微环境靶向材料CMCS-PEG-NGR(CPN)和 M2 型 TAMs 靶向材料 MPITC-PEI(MPEI),合成新型载药材料CMCS-DOX-PEG-NGR(CDPN),通过核磁氢谱对上述材料进行结构确证,采用紫外分光光度法测定CDPN中DOX的含量为16.48%,用酸碱滴定法测定CDPN的等电点为6.53。第五章成功构建异靶点逐级靶向核壳结构纳米载体CDPN/MPEI/siRNA(CDMPR)共递送DOX和siRNA至异靶细胞(肿瘤细胞和M2型TAMs)。首先利用静电吸附原理制备M2型TAMs靶向内核MPEI/siRNA(MPR),通过凝胶电泳确定当MPEI与siRNA质量比大于1:1时可装载siRNA,以粒径、电位、PDI作为考察指标,筛选出内核MPR最优处方为MPEI与siRNA质量比2:1,粒径为62.3±1.4nm,电位为27.1±2.2mV,形态圆整分散均匀。再将内核与肿瘤组织靶向载药外壳(CDPN)通过静电吸附组装形成CDMPR,考察不同CDPN与siRNA质量比的CDMPR粒径电位及分散性,筛选出CDMPR最优处方为CDPN与siRNA质量比8:1,粒径为168.5±1.0nm,电位为-9.0±2.3mV,纳米粒形态较为圆整。CDMPR有良好的血浆稳定性和抗核酸酶能力,可有效保护siRNA避免其被酶和血浆成分降解,由于外壳CDPN的电荷翻转作用具有pH敏感解聚特征,体外释放结果表明,pH6.5条件下48 h DOX的累积释放百分率达到52.92%±0.83%,较pH7.4(48 h累积释放百分率为17.95%±0.77%)相比均显著提高(p<0.01),具有pH敏感的释药特征。而siRNA在pH7.4条件下释放量显著低于pH6.5(p<0.01),表明siRNA在体循环中不容易被释放。第六章细胞摄取实验考察内核MPR的M2型RAW264.7靶向性,结果显示修饰甘露糖的MPR具有特异性靶向M2型RAW264.7细胞的能力,而未修饰甘露糖的PR细胞摄取不具有表型特异性。在不同pH条件下的细胞摄取实验结果表明,在pH6.5条件下外壳CDPN脱落,暴露内核促进内核入胞,而pH7.4条件下CDMPR入胞较少。采用Transwell模型建立M2型RAW264.7细胞与Hepa1-6细胞共培养模型,在该模型上进行细胞摄取实验结果显示,Cy3-siRNA从1h开始入胞,并持续存在于M2型RAW264.7细胞内,表明CDMPR可将Cy3-siRNA靶向递送至M2型RAW264.7细胞内;在Hepa1-6细胞中,DOX的红色荧光从4 h开始出现到12 h逐渐增强,而未发现siRNA的绿色荧光,表明DOX可被CDMPR递送至肿瘤细胞,而Cy3-siRNA不会被递送至肿瘤细胞。将CDMPR用于肿瘤化学免疫联合治疗中,CDMPR具有在Hepa1-6细胞系中有浓度依赖的细胞毒性和转染siRNA的能力。体外转染后RAW264.7细胞中IKKβ蛋白的表达量下降(p<0.05)。免疫荧光法和流式细胞术测定CDMPR对M2型RAW264.7细胞重极化的影响,与未修饰甘露糖的PR组相比,MPR和CDMPR组中M2型RAW264.7细胞量减少(p<0.05),CDMPR组的M1型RAW264.7细胞量较PR组明显增加(p<0.01),结果表明CDMPR具有促进M2型RAW264.7细胞向M1型重极化的效果。第七章建立Hepa1-6荷瘤小鼠模型,在该模型上对CDMPR的体内递送过程进行评价。肿瘤组织药物分布实验结果显示,CDMPR到达肿瘤组织后是先被M2型TAMs摄取,随后M2型TAMs作为药物储库将DOX释放出来,DOX再被肿瘤细胞摄取,而siRNA仅仅内摄于M2型TAMs不会被再次释放。小鼠活体成像实验结果表明CDMPR具有肿瘤组织特异性靶向共递送的能力。在Hepa1-6荷瘤小鼠上对CDMPR用于肿瘤化学免疫联合治疗进行体内药效评价和调节巨噬细胞极化及免疫因子的相关评价,较单独化疗和混合给药相比,CDMPR组瘤体积、M2型TAMs的含量均降低(p<0.05),M1型TAMs的含量增加(p<0.05),免疫抑制因子TGF-p1和IL-10含量降低(p<0.05),免疫激活因子IFN-y和IL-12含量升高(p<0.05),表明CDMPR组具有最优的体内抗肿瘤效果和调节巨噬细胞极化的作用,呈现一定程度的免疫激活状态。各组织器官的HE染色结果表明,CDMPR体内初步安全性良好。