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木霉属(Trichoderma)是产纤维素酶的代表属，其中有些种如里氏木霉、康宁木霉等已被开发为纤维素酶的工业生产菌。它们合成纤维素酶受纤维素、槐二糖等的诱导，同时受分解代谢物阻遏调控。葡萄糖分解代谢物阻遏蛋白(Crel)与纤维素酶阻遏蛋白(Acel)是木霉中功能相对明确的阻遏蛋白，即使在诱导条件下它们仍然起调控作用，抑制纤维素酶的表达。RNA干扰是近来发现的基因转录后表达调控现象，其作用模式为序列特异性而非位点特异性。相对于基因敲除技术，RNA干扰特别适合于对多核而又容易发生非同源重组的丝状真菌进行遗传改造。本工作以纤维素酶高产菌株康宁木霉YC01为研究对象，建立木霉YC01的RNA干扰体系，并期望通过RNA干扰提高康宁木霉YC01的产纤维素酶能力。
在木霉YC01中建立了有效的RNA干扰体系。构建了一株稳定表达DsRed的YC01重组菌株，向其中转入带木霉内含子发夹结构RNA(intron-containedhairpin RNA，ihpRNA)表达盒的DsRed沉默载体。经筛选，获得33株同时具有潮霉素和腐草霉素抗性的转化子。荧光强度分析结果表明红色荧光明显减弱的转化子占79％，其中有些转化子的红色荧光基本消失。选取红色荧光减弱程度不同的4株转化子作进一步鉴定。基因组PCR和序列分析的结果显示这些转化子基因组中存在完整的DsRed表达盒以及干扰序列，说明转化子荧光强度的减弱是由于干扰序列表达后沉默DsRed的表达。实时荧光定量PCR和Western blot的结果表明这些沉默转化子中DsRed的mRNA和蛋白质表达量均有不同程度的下调，与荧光强度分析结果大致相符。以上结果表明ihpRNA的表达能有效地下调目的基因的表达。
建立了对DsRed、crel、acel等多个基因同时进行RNA干扰的方法。以DsRed为报告基因，将多个基因的干扰序列连接起来作为hpRNA的茎部，以木霉内含子为环部，实现了两个(DsRed与acel)以及三个基因(DsRed、crel与acel)的同时沉默，根据红色荧光的变化即可初步筛选目的基因沉默转化子。实时荧光定量PCR结果显示靠近环部的DsRed mRNA基本被完全沉默，而远离环部的crel与acel只有部分沉默，说明多基因同时沉默时各基因受干扰的程度存在差异。共沉默转化子的产纤维酶能力与转入空载体的对照菌株相比有显著提高，但与出发菌株YC01相比基本相当，其原因是沉默载体中腐草霉素抗性基因的表达对纤维素酶的合成有较大影响。
acel的沉默可提高木霉YC01产纤维素酶和木聚糖酶的能力。构建了单独沉默arel的YC01沉默转化菌株，其中菌株A553中acel的表达在诱导条件下下调了29%。与对照菌株相比，A553在液体培养基中的生长没有明显的变化，但在固体培养时产孢子的能力较弱。在葡萄糖阻遏和诱导条件下，A553主要纤维素酶和木聚糖酶基因的表达量明显高于对照菌株，其中内切葡聚糖苷酶基因egll和egl2表达量提高的幅度最大。诱导条件下A553发酵液上清中的总蛋白含量、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖苷酶、木聚糖酶和滤纸酶活性分别是对照菌株的1.2、1.5、2.7、1.6和2.2倍，表明acel的沉默可以提高转化菌株产纤维素酶和木聚糖酶的能力。诱导条件下acel表达的下调使木聚糖酶调控蛋白Xyrl的表达增加，但不影响crel的表达，表明xyrl的转录受Acel的阻遏作用。
crel的沉默可提高木霉YC01产纤维素酶和木聚糖酶的能力。构建了单独沉默crel的YC01沉默转化菌株，其中菌株C313中crel的表达在诱导条件下下调了44%。在葡萄糖阻遏和诱导条件下，crel表达的下调可提高主要纤维素酶和木聚糖酶基因的表达水平，其中纤维二糖水解酶基因cbhl表达量提高的幅度最大，在诱导条件下是对照菌株的76倍。诱导条件下C313发酵液上清中的总蛋白含量、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和滤纸酶活性分别是对照菌株的1.2、2.2、1.8、1.3、1.8和3.1倍，表明crel的沉默可以提高转化子产纤维素酶和木聚糖酶的能力。诱导条件下crel表达的下调使xyrl的表达水平增加，但不影响acel的表达，表明xyrl的转录也受Crel的阻遏作用。
本工作在康宁木霉YC01中建立了有效的RNA干扰体系，通过RNA干扰分别使分解代谢物阻遏蛋白Crel和Acel的表达下调，并获得了产纤维素酶和木聚糖酶能力显著提高的工程菌株木霉A553和木霉C313，为深入理解丝状真菌纤维素酶和木聚糖酶的表达调控机制提供新的理论依据，也为改善工业真菌的遗传性状提供新的技术方法。