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研究从猪血中分离提取氯化血红素和凝血酶的工艺,建立了其定性和定量的分析方法。
猪血的抗凝处理、红细胞和血浆的分离。收集经检验合格的新鲜猪血,用0.38%的柠檬酸钠溶液与血液按体积比1:9混合抗凝,抗凝血在转速为4000r/min(离心力为1790g)下,离心10min,分别收集红细胞和血浆,用于提取氯化血红素和凝血酶。
研究了氯化血红素的提取条件。优化后的条件为:(1)加入红细胞体积1/5的去离子水,实验条件下,超声波功率200W,破碎10min,得到血红蛋白溶解液。(2)选用鞣酸法从超声波破碎红细胞得到的血红蛋白溶解液中提取氯化血红素。向血红蛋白溶液中加入红细胞体积5倍的丙酮,用1mol/L稀HCl调其pH值为2.2,抽滤,收集提取液。向提取液中加入5%鞣酸,静置12h后产生沉淀。抽滤,收集沉淀,并对其用去离子水、50%的乙酸、95%乙醇、乙醚依次各洗涤二次,所得产品放入干燥器避光干燥,最后得到红紫色固体。通过分析对比氯化血红素标准品和样品的红外光谱图和紫外/可见光谱图,确定所得产品为氯化血红素。
利用该工艺每1000ml猪血可以获得氯化血红素3.2克左右,纯度达到91%左右,收率为78%左右。用超声波法代替机械搅拌法对红细胞进行破碎,时间缩短了2/3,使氯化血红素的收率提高了15%左右。
建立和优化了凝血酶的分离纯化的条件:(1)血浆的预处理。血浆-20℃下冷冻一天,4℃解冻,可除去纤维蛋白原,所得凝血酶的总活性提高了3.7%。(2)凝血酶原的分离采用柠檬酸钡吸附法。1mol/L的氯化钡最适加入量为血浆体积的8%。(3)凝血酶原激活采用单独使用CaCl2法。通过研究Ca2+终浓度、激活温度、时间对凝血酶原激活的影响,获得优化后的激活条件为:Ca2+的终浓度为0.1mol/L,在25℃下激活2h。(4)采用DEAE-纤维素DE-52对凝血酶粗品进行纯化,pH7.2、0.05mol/LTris-HCl缓冲液上样,用含0~1.0mol/LNaCl的pH7.2、0.05mol/LTris-HCl缓冲液进行线性梯度洗脱,收集凝血酶活性峰,凝血酶的比活达到604.4U/mg,回收率为74.3%,纯化倍数为15.7。再经SephadexG-75进一步纯化,用pH7.2、0.05mol/LTris-HCl缓冲液上样、洗脱,得到凝血酶电泳单点纯,比活为998.6U/mg,回收率为55.7%,纯化倍数为25.9。
通过对血浆进行冷冻处理,使所得凝血酶的总活力提高了3.7%,同时也得到了凝血酶的底物—纤维蛋白原。单独使用CaCl2激活凝血酶原,避免了添加凝血促凝酶或蛇毒等激活物,引入杂蛋白或带来不安全因素。通过分离纯化得到了电泳纯凝血酶。