论文部分内容阅读
特殊生境微生物具有独特的基因类型,特殊的生理及代谢机制,能够产生新型生物活性物质和先导化合物(如抗生素、酶、脂类及多糖等),是潜在的新生防因子资源库,也是目前微生物资源开发的一个新热点。本研究针对近年来生产上危害较严重的甘蓝枯萎和番茄灰霉病害进行了特殊生境生防微生物资源的筛选,为有效控制该病害的生防微生物产品的开发应用奠定基础。试验共筛选了来自漠河永冻层、西藏雪域高原、海洋红树林等特殊生境微生物728株,获得拮抗甘蓝枯萎病菌和番茄灰霉病菌的放线菌11株,细菌40株。16S r DNA初步鉴定芽孢杆菌属(Bacillus sp.)是其优势菌群。分离自西藏色季拉山海拔4530 m草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas sp.)ZL261,是一株菌落形态和培养特征较特殊,国外研究较少,我国尚无报道和记载的生防相关稀有种质资源,将其作为研究重点从抑菌活性、分类地位、功能相关基因克隆与分析方面做了系统的研究。结果概括如下:菌株ZL261抑菌活性具有较强的专化性,在所供试的病原真菌、细菌、酵母菌中,仅对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)有特异性抑制作用,而对其它病原菌均无抑制作用;其发酵液对桃褐腐病菌(M.fructicola)的离体防效高达86.21%;能够产生嗜铁素、蛋白酶、几丁质酶及磷酸酯酶等多种生防相关物质。经形态特征、培养条件、生理生化测定、16S r DNA序列比对和DNA-DNA杂交分析,菌株ZL261鉴定为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis),是我国一新纪录属。通过构建基因组文库和活性筛选的方法,克隆分析了菌株ZL261蛋白酶基因,并对其异源表达和酶学特性做了进一步的研究。结果表明:该蛋白酶基因(命名为capro)完整开放阅读框长为1092 bp(Gen Bank:KF992845),编码363个氨基酸组成的蛋白;序列比对和同源性分析结果显示,氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌(C.fungivorans)Ter331胞外蛋白酶序列(NC015856)相似性最高,为83%;一级、二级和三级结构分析均显示该蛋白含M35金属蛋白酶家族(EC 3.4.24.20)保守结构域。基因在大肠杆菌DH5α中成功异源表达,获得了约38 k Da的目的蛋白,蛋白粗酶液对金属蛋白酶抑制剂EDTA敏感,最适作用p H为7,最适温度30℃,在10℃时仍保持70%以上酶活力。综合试验结果可知,该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶。依据已报道的食真菌山冈单胞菌(C.fungivorans)Ter331(NC015856)胞外内切几丁质酶基因chi I(EU599185.1)相关序列设计引物,利用分段扩增的方法克隆了菌株ZL261几丁质酶基因,对其序列和编码蛋白的氨基酸序列分析表明,chi IQ开放阅读框(ORF)长1338 bp(Gen Bank:KJ704781),编码蛋白由445个氨基酸组成,分子量为46.04 k D,等电点为5.67。序列比对和同源性分析发现,该基因与食真菌山冈单胞菌Ter331几丁质酶基因chi I序列(ACF93782.1)相似性最高,为92%,其氨基酸序列含几丁质酶GH18家族高度保守序列SXGG和GXDXDXE,因此,Chi IQ几丁质酶属GH 18家族。采用限制性内切酶Bam H I和Hind III,利用双酶切法构建了ZL261几丁质酶基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。