【摘 要】
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抗虫棉的广泛种植减少了大量农药的施用,使次要靶标害虫斜纹夜蛾转向危害数量上升,但其他农作物上长期以来对斜纹夜蛾的防治手段仍依赖于化学防治,致使其抗药性问题日益突出。有关斜纹夜蛾抗药性的研究较多,但抗性机制仍不够清楚。本研究首先分析斜纹夜蛾取食不同处理条件下抗虫棉和抗除草剂棉后生育历期、化蛹率、羽化率等生物学特性的变化;然后采用16s rRNA高通量测序分析不同农药处理条件下抗虫棉和抗除草剂棉及其不
【基金项目】
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转基因生物新品种培育重大专项课题 《农业生态风险监测与控制技术》(项目编号:2016ZX08012-004);
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抗虫棉的广泛种植减少了大量农药的施用,使次要靶标害虫斜纹夜蛾转向危害数量上升,但其他农作物上长期以来对斜纹夜蛾的防治手段仍依赖于化学防治,致使其抗药性问题日益突出。有关斜纹夜蛾抗药性的研究较多,但抗性机制仍不够清楚。本研究首先分析斜纹夜蛾取食不同处理条件下抗虫棉和抗除草剂棉后生育历期、化蛹率、羽化率等生物学特性的变化;然后采用16s rRNA高通量测序分析不同农药处理条件下抗虫棉和抗除草剂棉及其不同组织对斜纹夜蛾肠道微生物多样性影响;进一步利用动态转录组组织分析斜纹夜蛾对农药响应过程中的药物代谢途径变化和响应农药的关键通路及相关基因;并对影响肠道微生物和响应农药代谢通路上的关键基因TLRs进行全基因组鉴定,并对这些介导农药的抗药性基因进行验证。本研究对于明确抗虫棉和抗除草剂棉对斜纹夜蛾肠道微生物多样性和抗药性效应,对加强斜纹夜蛾抗性治理具有重要的意义,同时为害虫抗性的研究和治理提供了新方法和理论依据。研究取得以下结果:1.以抗虫棉为对照,抗草甘膦棉饲喂的斜纹夜蛾在日龄重、化蛹率、羽化率、生育历期无显著差异性,说明转基因抗草甘膦棉对非目标生物斜纹夜蛾能达到抗虫棉安全级别;但是用草甘膦除草剂处理抗草甘膦棉后,处理组化蛹率、羽化率和雄性蛹重较对照组显著减少,说明草甘膦会影响非目标生物斜纹夜蛾的生长发育。大田试验中,用喷施和未喷施草甘膦的抗草甘膦棉饲喂斜纹夜蛾幼虫,四龄幼虫肠道细菌丰度达到显著差异的是棒状杆菌(Corynebacterium)且与处理成负相关性;在五龄幼虫肠道细菌丰度达到显著差异的是与药剂处理成正相关性的雷尔氏菌(Ralstonia);进一步分析差异菌功能,发现共有差异菌富集4种功能,分别是Amino acid transport and metabolism、Carbohydrate transport and metabolism、Translation,ribosomal structure and biogenesis、Translation,说明涉及这几个功能的微生物在响应除草剂草甘膦过程中有重要作用。2.利用常用农药阿维菌素、苦参碱添加人工饲料饲喂斜纹夜蛾三龄幼虫72h后,取中肠及体壁样本,进行16S rRNA高通量测序分析肠道菌群的分布和丰度,发现农药处理组和对照组之间,共同的优势菌为肠球菌(Enterococcus);肠道菌群存在显著差异(P<0.05)农药处理后丰度增加的是疣微菌(Verrucomicrobia);属水平上其他显著差异菌八种。对幼虫肠道以外的体壁细菌类群丰度差异分析,发现处理组和对照组在门水平上存在一个显著差异菌是螺旋体菌(Saccharibacteria),农药处理组丰度上升,在属水平有显著差异的菌丰度与处理组全部成正相关表达,且达到26类之多,这些与农药处理组正相关的各种菌多与农药代谢、抗性形成有关。3.以斜纹夜蛾五龄幼虫为研究对象,对人工饲料和人工饲料添加杀虫剂饲喂斜纹夜蛾后6h、12h、24h、48h和72h进行转录组比较分析,并构建斜纹夜蛾农药代谢动态转录图谱,发现幼虫在12 h时对杀虫剂以P450代谢为主要机制,随后参与该机制的基因数量逐渐增加,在48小时后,响应杀虫剂的机制变为以TOLL和IMD代谢机制为主,通过RT-q PCR验证这些基因的表达趋势与转录组趋势一致。使用加权相关网络分析进一步确定了与在12h和24h时的杀虫剂反应相关的共表达模块成显著相关(r=0.403,P=0.0371;r=0.436,P=0.023),从这些共表达模块中进一步分析出48个与杀虫剂反应相关的候选基因。4.利用公布斜纹夜蛾基因组对TLRs基因进行全基因组鉴定,共鉴定出了7个TLRs基因,进一步利用生物信息学工具分析斜纹夜蛾TLRs家族基因成员在鳞翅目害虫TLRs基因家族中的进化关系,发现斜纹夜蛾的TLRs家族基因与棉铃虫TLRs家族基因同源性较高;对这7个基因进行组织特异性表达分析表明LOC111354111在肠道中高度表达,并同时发现了5个基因对农药处理产生了积极响应;结合转录组数据对产生农药响应的TLRs进行基因表达网络进行鉴定,发现LOC111357546和其他30个基因之间存在共表达关系,这些基因主要涉及细胞表面受体信号途径、细胞定位、信号传导、细胞调控过程、生物调控过程,这些基因的发现为斜纹夜蛾抗药性机制的深入研究奠定了基础。
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