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目的：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)逆转录酶(Reverse Transcriptase，RT.)基因区YMDD(酪-蛋-门-门，nt738-749)基因变异，是1996年发现的一种HBV耐药变异基因。该变异已被证实与长期使用核苷类药物，如拉米夫定(3TC)直接相关。3TC作为治疗慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)的首选药物已被广泛应用于临床。但随着HBV YMDD耐药变异株的出现，患者对3TC的敏感性将大幅度降低，并可最终引起病情复发甚至死亡。因此获得和克隆HBV YMDD耐药变异基因，并建立敏感性高、快速、实用的HBV YMDD耐药基因变异检测方法，对于研究HBV耐药变异和指导临床用药有着极其重要的意义。 方法：特异基因序列固相多聚酶链反应技术(Sequence-specific solid phase PCR，SS—SPPCR)是目前国外应用较为普遍的一种核酸分子检测技术。该技术原理系采用PCR技术，标记变异探针与患者DNA片断进行液相杂交，杂交产物标记信号经酶联免疫吸附实验(ELISA)放大显色，酶标仪读取光密度值(OD)值并判定结果。此项技术敏感性、特异性方面与经典的Southern Blot相当，而且具备简便、快速、对设备要求低的优势，非常适合在我国临床常规试验室开展工作。我们 中文摘要将通过以下三个步骤建立检测HBV YMDD耐药变异基因的55一SPPCR方法并进行灵敏性与特异性评价:1 .HBVYMDD基因变异模式质粒的构建;2.55一SPPCR实验条件和方法的建立;3.55一SPPCR灵敏性和特异性评价及实际应用的评估。一首先构建出常见HBV YMDD基因变异模式质粒。选择野毒型HBV oNA一(nt 1 71一985)为目标克隆片段，设计合成外测扩增引物1对和内侧变异引物4对。以HBV野毒型质粒(pMS)为模板，进行两轮PCR扩增，产物经纯化回收后直接连接至pGEM一T克隆载体，构建出HBV YMDD基因变异模式质粒:p一Vgtg、p一Iatt、p一Iatc、p一Iata。转化大肠杆菌DHSQ，小量提取重组质粒经酶切和序列分析鉴定。然后与pMS共同进行紫外定量并计算拷贝数，并将5种质粒均稀释至同一拷贝数值备用。55一SPPCR检测方法主要包括三个环节:探针一及引物设计合成;液相杂交反应条件的确定;和ELISA检测条件的确定。设计合成野毒和部分变异cDNA探针(P)两组。一组J几5’端标记生物索:包括PAI、一。i。(检测pMS)、pGT。一。i。(检测p一Vgtg)、p、二一Bi。(检测p一Iatt)，另一组核酸序列相同但不作标记(PAI。、PGl’G、、PATT)。另设计一合成扩增引物1对，卜游引物标记地高辛(Dig)。分别以4份正常人血清提取的DNA、pMS，p一Iatt为模板于常规条件下 (55℃退火)进行PCR扩增。扩增产物5’端带有地高辛，用作于液相杂交反应的DNA材料。液相杂交反应条件主要通过改变杂交复性温度来选择。1.确定野毒型pMS质粒液相杂交复性温度及55一SPPCR阳性界值。选择杂交复性温度为35℃、40℃、45℃，杂交10个循环;以PATG 2中文摘要一Bi。与分别与4份正常人提取DNA的杂交产物、PATG探针与pMS片段杂交产物的检测信号为阴性对照，PATG一Bio探针与pMS杂交检测信号为阳性对照，杂交产物经ELISA检测。选择杂交检测反应模式最好的温度为pMS检测最适杂交复性条件。计算55一SPPCR阳性界值二均值十2.58x标准差。2.确定p一Iatt杂交检测条件。PATT一Bi。分别与正常人血清DNA、pMS杂交检测信号作为阴性对照，用PATT一Bi。与pMS和p一Iatt质粒混合物杂交检测信号作为阳性对照，升高杂交温度，选择p一fatt检测反应模式最好的复性温度为p一Iatt杂交检测条件。ELISA反应条件确立:l抗体包被浓度的选择:抗地高辛抗体Fab片段按浓度(10一0.5 99巾包被微孔板，经杂交检测后选择反应模式较好之最低浓度为抗体包被浓度。2.avidine~HRP使用浓度的选择:ELISA检测时加入不同稀释度的avidine-HRP，选择反应模式较好之avidine~HRP最大稀释度为使用浓度。3.缓冲液选择:对比使川PBS(PH 7.4)缓冲液、碳酸盐缓冲液(PHg.0)分别作为抗体包被缓冲液，选择反应模式较好的缓冲液(PHg.0)作为包被缓冲液。55一SPPCR方法灵敏性与特异性评价。1.灵敏性评价选择pMs作为研究对象。以PATG一Bi。与正常血清DNA杂交信号作为阴性对照。将pMS进行一系列浓度稀释，并进行PCR扩增。运用PATG一 Bi。对稀释pMS扩增产物逐一进行检测，杂交反应条件为40℃10个循环。2.评价特异性时一，将pMS、p一Iatt质粒进行不同比例混合并进行PCR扩增，PATr一Bi。与正常血清DNA、pMS杂交检测信号同为为阴性对照。用PATT一Bi。对混合物的扩增产物进行55一SPPCR检测。分别通过 中文摘要检测结果对其灵敏性和特异性进行评估。 结果:本研究的主要进展和结果有:1.应用分子克隆和点突变技术成功构建完成了HBV YMDD特异基因变异模式质粒:p一Vgtg、p一Iatt、p一Iate、p一Iata，并成功的应用于55一SPPCR方法的建立和评价中;2.掌握了快速检测部分HBV YMDD特异点突变的55一SPPCR的关键技术