小窝蛋白1基因敲除对小梁细胞基因表达的影响

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目的:发现小梁细胞水平上可能参与POAG发生的CAV1相关基因。  方法:利用 PCR检测相关基因的表达进行小梁细胞的分子鉴定;截取小梁细胞株经单克隆培养传代的2个阶段,qPCR检测部分基因在小梁细胞株(HTM-1 cell line)表达的稳定性;利用CRISPR/Cas9在小梁细胞株敲除CAV1, qPCR检测 CAV1相关基因的表达水平,通过表达的差异性(CAV1-KO/WT),发现可能参与POAG发生的CAV1相关基因。  结果:1、小梁细胞的分子鉴定:FN1、CAV1、CAV2、LAMA5、LAMB1、LAMC1、GADPH在小梁细胞株、正常人小梁组织(TM Tissue)、正常人角膜组织(Corneal Tissue)、HLE-B3、Hela、HepG2 cell lines的表达检测结果为阳性;F8在 HTM-1、TM Tissue、 Corneal Tissue为阴性,在HLE-B3、Hela、 HepG2 cell lines阳性;EON2在HTM-1、THLE-B3、Hela、HepG2 cell lines、TM Tissue阳性,Corneal Tissue阴性;ACTA2在HTM-1、THLE-B3、Hela cell lines、TM Tissue、Corneal Tissue阳性,HepG2 cell line阴性。2、相关基因在小梁细胞株的表达稳定性:FN1、CAV1、CAV2、LAMA5、LAMB1、LAMC1、ENO2、GADPH在HTM-1 cell line传代表达相对稳定,第一阶段为0.40~2.80,第二阶段0.5~2.30;ACTA2在第一阶段0.04~1.308,第二阶段0.50~0.230。3、 CAV1敲除的其他相关基因的差异性表达:CRISPR/Cas9敲除CAV1,得CAV1-KO01、02、03三株细胞株,不同的 CAV1-KO株,不同的基因的相对表达量呈现不同的差异,CAV2在01、03株分别为0.78、0.48,02株差异不明显,为1.16;TGFB在01、02株差异表达为1.09、1.26,03株为0.46;COL1A1在01、02株分别为1.10、1.48,03株为0.30;FABP6在01株为1.43,02、03株分别为0.83、0.38;FN1、CD44、ACTA2、ATOH7差异倍数小于1,与野生型相比表达量呈下调趋势;LAMB1、LAMA5、ENO2、PRKCE、DNM2差异倍数大于1,表达呈上调趋势。  结论:1、 F8、ACTA2、ENO2可在分子水平上对小梁细胞特性做出鉴定,为进一步认识小梁的功能特性提供方向,其他组织转化成小梁提供依据。2、CAV1敲除后,小梁细胞中 PRKCE、DNM2呈上调,FN1、ACTA2下调;提示CAV1通过其他基因如PRKCE、DNM2、FN1、ACTA2的改变而改变小梁细胞的功能,从而参与POAG的发生。
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