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研究目的:砷(As)、铅(Pb)、汞(Hg)、镉(Cd)是我国首个“十二五”专项规划——《重金属污染综合防治“十二五”规划》中重点防控的重金属。国内外的流行病学和毒理学研究都已经分别确认Pb、Hg、Cd、As(以下简称四金属)的急性或慢性中毒可以导致神经系统疾病、消化系统疾病、心血管疾病、癌症等多种疾病发生。然而,实际生产生活中,这几种重金属并不是单独存在,而是同时共存于我们赖以生存的空气、土壤、水和食物中。对于现今的环境低剂量和多种重金属联合暴露是否能造成脑结构和/或功能损伤备受关注,也是环境毒理学研究的热点和重点,但对于该四种金属的联合暴露未有研究阐明其毒性作用及其可能的相关机制。为此,本研究通过建立环境低剂量四金属联合暴露的大鼠模型,探讨四金属联合暴露对大鼠生长发育和神经行为、神经突触结构的影响及其可能的作用机制。实验方法:1、动物模型建立:性成熟SPF级SD大鼠(雌雄2:1)合笼,将孕鼠在怀孕当天随机分置对照组(Control)、1x MM组(低剂量组)、5x MM组(较低剂量组)、10x MM组(较高剂量组)和20x MM组(高剂量组)。分别饮用蒸馏水,含有25mg/L三水乙酸铅、7.5mg/L氯化镉、0.05 mg/L亚砷酸钠和0.15 mg/L氯化汞(1x MM组混合染毒液)的四金属混合染毒液以及等同于1x MM组混合染毒液5倍浓度、10倍浓度和20倍浓度的染毒液,直至仔鼠出生后第23天(PND23,即断乳时)。2、仔鼠生长发育及神经行为检测:通过观察测量子一代仔鼠(F1)出生时生理发育指标(身长、尾长、肛殖距)、体重改变及染毒结束时解剖检查来评估四金属联合暴露对仔鼠生长发育的影响。在仔鼠出生后特定的天龄,进行平面翻正(PND4、7)、负趋地性(PND7)、悬崖回避(PND7)、甩尾(PND10)等行为功能测试,检测环境四金属联合暴露对F1的早期神经行为的影响;避暗实验(PND17-18)及Morris水迷宫(PND17-PND22),检测四金属对仔鼠学习记忆能力的影响。3、全血及全脑四种重金属元素含量测定:在PND23时,使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和原子荧光(AFS)分别检测全血/全脑中Pb、Cd和As、Hg含量。4、神经突触结构的检测:使用透射电镜技术,观察F1海马神经元突触结构改变。5、SPAR、Snk基因和蛋白表达测定:使用逆转录PCR(RT-PCR)检测海马SPAR、Snk mRNA表达改变;使用免疫荧光检测SPAR、Snk蛋白在海马的表达改变。实验结果:1、四金属联合暴露对仔鼠生长发育和神经行为的影响环境重金属联合暴露影响F1体重的增加(P<0.05),各脏器如大脑、小脑、心脏、肾脏的脏器系数随剂量增加呈一定上升趋势(P<0.05)。环境重金属联合暴露对大鼠的神经行为发育的影响。在运动平衡方面,平面翻正行为功能测试结果显示,在PND7时各染毒组的翻正得分均小于对照组(P<0.05);在PND12时后肢撑力行为功能测试中,除1x MM组外,其他各染毒组随剂量增加,调整后肢撑力系数呈一定的上升趋势(P<0.05)。在知觉感觉方面,在PND9时悬崖回避行为功能测试中,各染毒组回避得分随剂量增加呈一定的下降趋势(P<0.05),而在PND10时甩尾行为功能测试中,各组虽然存在一定的上升趋势,但仅有10x MM组和20x MM甩尾时间高于对照组(P<0.05)。在学习记忆方面,在PND18时避暗实验结果显示,记忆错误次数除1x MM组以外,其他各染毒组随剂量增加呈上升趋势(P<0.05),而Morris水迷宫仅观察到10x MM组和20x MM出现逃避潜伏时间高于对照组(P<0.05)。2、四金属联合暴露对仔鼠血液及脑中四种重金属元素含量的影响仔鼠血液及脑中四种重金属含量均随染毒剂量增加呈梯度上升趋势(P<0.05),且1x MM组血液Pb、Cd、As、Hg重金属含量(ug/L)分别为10.60±3.95、0.41±0.11、1.98±0.15、0.82±0.04。3、四金属联合暴露对神经突触结构的影响通过透射电镜可以观察到,从10x MM组开始出现细胞器数目减少,线粒体轻度肿胀,部分嵴断裂,但核膜仍光滑,染色质均匀分布;而随着金属混合物暴露剂量增加至20MM组时,大鼠海马神经元出现核内染色质边集、聚集成团,但核膜尚完整,细胞器数目稀少,线粒体出现较严重的肿胀,嵴断裂融散,模糊不清。神经元突触密度和PSD厚度从5x MM开始较对照组有所下降(P<0.05),而神经元突触间隙仅有20x MM组较对照组有所增加(P<0.05)。4、四金属联合暴露对海马SPAR、Snk基因及蛋白表达的影响SPAR蛋白表达在1x MM组较对照组有所上升(P<0.05),而其他染毒组低于对照组(P<0.05),但SPAR、Snk mRNA和Snk蛋白表达并未发现各组之间的差异(P>0.05)。结论:1、低剂量Pb、Hg、Cd、As联合暴露会造成仔鼠的生长发育改变;2、低剂量Pb、Hg、Cd、As联合暴露会造成仔鼠的神经运动、感觉和学习记忆损伤;3、低剂量Pb、Hg、Cd、As联合暴露影响大鼠海马神经突触的数量、结构和功能,并可能通过下调SPAR蛋白表达引起大鼠海马神经突触改变。