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目的:穿心莲内酯(Andrographolide)是从常用的中药穿心莲中提取的二萜内酯类化合物,具有广泛的生物活性。为了更贴近于临床,起到老药新用的目的,本课题拟通过对穿心莲内酯抗炎活性及作用机制的更深入研究,发现新的抗炎靶点,并为抗炎药物的开发提供科学依据。方法:采用MTT法比较不同浓度的穿心莲内酯对细胞存活率的影响。使用穿心莲内酯预处理巨噬细胞后,再用LPS诱导炎症反应,运用Griess法和Western Blot(WB)实验检测一氧化氮(NO)及其相关蛋白i NOS和COX-2表达水平;采用ELISA和RT-PCR法检测细胞因子的产生量和分泌量;采用WB实验检测NF-?B,MAPK以及上游信号通路蛋白表达水平;运用细胞核质分离技术和免疫荧光实验检测穿NF-?B和AP-1核转位情况。利用细胞内信号阵列实验和WB实验检测穿心莲内酯对LPS诱导的RAW264.7细胞中与炎症、代谢、凋亡等相关信号通路上的一些特异性标志蛋白的作用;选用AMPK激活剂AICAR和抑制剂Compound C与穿心莲内酯对AMPK/NF-?B/MAPK信号通路中蛋白水平的影响相比较。运用si RNA转染方法AMPK?2基因沉默后,检测穿心莲内酯对NO的产生、AMPK/NF-?B/MAPK信号通路的蛋白水平和转入因子NF-?B及AP-1核转位的影响。经过建立DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型,利用小鼠疾病活动度指数(DAI)、H&E染色和IHC法检测病理症状和组织形状变化,采用PCR和ELISA测定在结肠和脾脏中促炎因子水平,并通过WB法检测在结肠组织中AMPK/NF-?B/MAPK信号通路的蛋白表达。结果:穿心莲内酯在无细胞毒性的情况下抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌NO及其相关蛋白i NOS和COX-2的表达;降低IL-6、TNF-?和IL-1?的产生及m RNA水平;抑制NF-?B、MAPK和其上游信号通路的活化;抑制NF-?B和AP-1的核转位。穿心莲内酯在LPS诱导的巨噬细胞中能够抑制Akt、m TOR、Bad、p70S6K、PRAS40、S6RP、Stat1和Stat3蛋白的磷酸化水平及cleaved Caspase-3蛋白的激活,且显著增加LKB1、AMPK?、ACC和GSK3?磷酸化;穿心莲内酯对AMPK通路的调控作用与AMPK激活剂AICAR的效果相似。AMPK?2基因沉默后,穿心莲内酯不可抑制NO的产生;对AMPK/NF-?B/MAPK信号通路的蛋白水平和转入因子NF-?B及AP-1核转位无明显调控效果。在DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型中,穿心莲内酯高剂量组与DSS组比较小鼠疾病活动度指数明显下降,结肠长度明显增长;小鼠结肠黏膜周围上皮细胞缺损不明显,其基本形态与正常组相似,浸润的巨噬细胞数量也减少;降低结肠和脾脏组织中IL-6、TNF-?和IL-1?的产生及m RNA水平;抑制结肠组织中NF-?B和MAPK通路蛋白的磷酸化,同时激活AMPK信号通路。结论:穿心莲内酯可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应,其抗炎机制主要通过激活AMPK?2来抑制NF-?B和MAPK信号通路,减轻炎症反应,从而改善DSS诱导的小鼠急性结肠炎。