论文部分内容阅读
目的：研究苦豆碱对肾脏缺血再灌注的保护作用及可能的作用机制。 方法：通过使用动脉夹夹住小鼠双侧肾蒂45分钟然后再松开动脉夹的方法建立小鼠肾脏缺血再灌注模型。18只C57/B6小鼠随机分为三组： (1)缺血再灌注—苦豆碱组，缺血再灌注前连续8天灌胃给与苦豆碱（Q1962,卡迈舒，上海）预处理，苦豆碱溶解于含10％冰乙酸的生理盐水中（2.5mg/ml），给药浓度为50mg/kg；第9天行缺血再灌注手术，其中缺血45min，再灌注24h后牺牲小鼠。 (2)缺血再灌注—介质组：缺血再灌注前给予等量的含10%冰乙酸的生理盐水预处理；第9天行缺血再灌注手术，其中缺血45min，再灌注24h后牺牲小鼠。 (3)假手术组：类似缺血再灌注手术流程但不使用动脉夹，给予等量的含10%冰乙酸的生理盐水预处理，再灌注24小时后牺牲小鼠。收集血清和肾脏组织样品。通过血清检测肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平以反映肾功能。HE和PAS染色用来评价肾脏损伤程度，包括：肾小管坏死，刷状缘和基底膜的完整程度以及管型形成的多少。肾脏组织切片进行MPO和F4/80的免疫组织化学染色以定量分析中性粒细胞和巨噬细胞的炎性浸润。IL-1β，IL-10和 IFN-γ通过RT-PCR来检测。肾小管上皮细胞的凋亡是通过TUNEL检测试剂盒以及Caspase3的蛋白表达水平来检测。SOD和MDA的水平和活性通过南京建成生物研究所的SOD和MDA检测试剂盒检测。PI3Kp85，Akt，mTOR，NFκBp65，c-fos和Bcl2的表达水平和活性通过Western Blot来检测。NFκBp65和AP-1（c-fos）的DNA结合活性通过凝胶电泳迁移率实验(EMSA)来检测。 结果：与缺血再灌注—介质组相比，缺血再灌注—苦豆碱组的小鼠肾脏功能和形态学改变明显受到保护；中性粒细胞和巨噬细胞的浸润情况也明显减少；同时促炎细胞因子IL-1β和IFN-γ的水平也相应减少，而抗炎因子IL-10则增多。苦豆碱预处理的缺血再灌注小鼠比缺血再灌注对照组小鼠的肾小管上皮细胞凋亡减少；SOD的水平则相应增加，这表明ROS的聚集减少；总的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的蛋白表达水平无明显差别，但是磷酸化的PI3Kp85，Akt,mTOR和NFκB p65的表达水平则减少，c-fos和Bcl2相应增加，NFκB与c-fos的EMSA结果与Western Blot相似，而假手术组的所有检测指标都相应正常。 结论：苦豆碱可以减轻小鼠肾脏缺血再灌注损伤，其作用机制可能与苦豆碱能够下调PI3Kp85/Akt/mTOR通路而抑制炎症反应和凋亡有关。