【摘 要】
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提取牛肌肉组织DNA,以PCR的方法得到牛精蛋白基因组基因,去其内含子,得到牛精蛋白cDNA,将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中,组装成原核表达载体pGEX-2T-Pc.利用大肠杆菌偏好的
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提取牛肌肉组织DNA,以PCR的方法得到牛精蛋白基因组基因,去其内含子,得到牛精蛋白cDNA,将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中,组装成原核表达载体pGEX-2T-Pc.利用大肠杆菌偏好的编码精氨酸的密码子CGT将野生型牛精蛋白基因中编码精氨酸的大肠杆菌稀有密码子（AGA或AGG）替换掉,通过基因合成得到密码子优化的牛精蛋白基因,将其克隆入原核表达载体PGEX-2T中,组装成原核表达载体pGEX-2T-Pc.将这两个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株BL21中,经IPTG诱导,同样条件下,野生型牛精蛋白基因无法得到表达,而密码子优化的牛精蛋白基因能够得到表达,表达带约在33KD的位置,但其表达量较低,表达产物约占细菌总蛋白的13﹪.增加表达菌株培养液的盐离子浓度,可提高表达带的百分含量达到28﹪,且盐离子浓度与表达含量呈正相关.将表达蛋白纯化,进行DNA-精蛋白结合实验,发现其能与DNA发生特异性的结合.加入盐离子会解除精蛋白与DNA的结合,随着盐离子浓度的增加精蛋白与DNA的结合能力会逐渐下降.以PCR的方法扩增pGEX-T-Ps得到密码子优化的牛精蛋白cDNA基因,将其以正确阅读框克隆入pET-5a-sp18中,得到原核表达载体pET-5a-Ps+sp18,再以PCR的方法扩增得到牛精蛋白+mSP18基因序列,将其以正确阅读框克隆入PGEX-2T中,组装成核表达载体pGEX-2T-Ps+sp18.将pGEX-2T-Ps+sp18表达载体转化入大肠杆菌表达菌株BL21中,经IPTG诱导,在50KD左右位置得到一表达带,但表达量很低,表达产物只占到细菌总蛋白的5﹪.增加表达菌株培养液的离子强度,可提高表达带百分含量到18.9﹪,且离子强度与表达含量呈正相关.将线性化的质粒DNApEGFP-C1用6-甲基诺丹明-6-dUTP进行标记,然后利用抗mSP18抗体及牛精蛋白+mSP18融合蛋白使DNA通过免疫学途径与精子结合.荧光显微镜下观察发现,64﹪的精子都带有荧光,激光共聚焦显微镜下观察到精子所带荧光的位置在精子头后部区域,与抗mSP18抗体与精子结合区域相符.
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