【摘 要】
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烟曲霉是一种腐生真菌，在自然界的碳、氮循环中起重要作用。近年来，烟曲霉已经成为主要的通过空气传播的致病真菌，在免疫缺陷病人体内引起致命的侵袭性感染。已知微生物糖链
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烟曲霉是一种腐生真菌，在自然界的碳、氮循环中起重要作用。近年来，烟曲霉已经成为主要的通过空气传播的致病真菌，在免疫缺陷病人体内引起致命的侵袭性感染。已知微生物糖链与其致病性密切相关，烟曲霉所产生的糖链是否也与其感染相关是一个值得研究的问题。但目前对真菌糖基化的了解仍局限于酿酒酵母分泌蛋白的糖基化修饰，烟曲霉分泌蛋白的糖链结构未见报道。
本研究以烟曲霉几丁质酶为模式分子，用荧光基团辅助的糖电泳(FACE)和HPAEC-PAD分析烟曲霉分泌的糖蛋白的糖链结构。结果表明，构成烟曲霉糖蛋白糖链的单糖组分为：N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、甘露糖(Man)和半乳糖(Gal)；N-糖链由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和甘露糖(Man)组成，所构成的N-糖链有三种糖型：Man6GlcNAc2-Asn、GlcNAc2-Asn和GlcNAc1-Asn，摩尔比为：18﹪、39﹪和43﹪；O-糖链为：Man-Ser/Thr和一种新结构Gal-Man-Ser/Thr,比例分别为64﹪和36﹪。
为探讨糖基化的作用，本文解析了几丁质酶天然糖蛋白的晶体结构。在以终浓度为36﹪的PEG为沉淀剂、蛋白浓度为5mg/ml时，用悬滴扩散法得到具有衍射能力的天然几丁质酶糖蛋白单晶，体积为0.4×0.15×0.05mm，衍射分辨力为2.1A。以Coccidioidesimmitis几丁质酶1为模型进行分子置换法构建烟曲霉几丁质酶结构模型，在结构上明确了Asn263位的N-糖基化不参与酶活性中心的形成。有实验证据证明该糖链可以稳定酶的结构。
为揭示O-糖链的功能，本文还对负责合成O-糖链的关键酶进行了研究。通过RT-PCR克隆得到烟曲霉O-甘露糖基转移酶1基因，开放读码框全长2346bp，编码781个氨基酸。通过TMpred软件预测的疏水区显示，在氨基端和羧基端中间是一个大的疏水区，包含七段跨膜区，并定位在内质网内膜上。烟曲霉O-甘露糖基转移酶1基因敲除后，突变株的O-甘露糖基转移酶酶活性为野生株的7.2﹪，几丁质酶的O-甘露糖基化减少80﹪；突变株在42℃时生长速度减慢，菌丝的生长受阻；同时对抗真菌药物潮霉素、Calcofluorwhite的敏感性增加。通过建立小鼠免疫缺陷烟曲霉感染模型，证明在小鼠正常体温条件下，敲除烟曲霉O-甘露糖基转移酶1基因对菌株的毒力没有影响。
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