【摘 要】
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目的：心肌缺血再灌注损伤是严重威胁人们健康的重大疾病,目前仍缺乏有效的心肌保护措施。本课题拟探讨microRNA(miRNA)在心肌缺血再灌注损伤中的作用与机制。 方法：(1)建立
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目的：心肌缺血再灌注损伤是严重威胁人们健康的重大疾病,目前仍缺乏有效的心肌保护措施。本课题拟探讨microRNA(miRNA)在心肌缺血再灌注损伤中的作用与机制。
方法：(1)建立大鼠心肌缺血再灌注和缺血预适应模型,应用microRNA芯片筛查表达变化的miRNAs,应用实时定量PCR加以验证：(2)建立离体心肌细胞氧化损伤模型,应用MTT、Tunnel、LDH酶学检测等方法对芯片筛选出的miRNA进行功能学研究；(3)应用luciferase报告基因技术、western blot技术以及实时定量PCR技术分析microRNA调控心肌损伤的机制。
结果：(1)microRNA芯片筛查结果表明,心肌缺血再灌注损伤导致33个微小RNA的表达变化2倍以上,其中20个上调,13个下调,尤以miR-1和miR-328变化显著。缺血预处理可部分对抗缺血再灌注损伤导致的miRNA表达改变,使8个上调的miRNA表达恢复,包括miR-1和miR-328。实时定量PCR结果表明,缺血再灌注损伤使心肌miR-1的表达上调3.7倍,miR-328的表达较正常组上调5倍；经缺血预处理后miR-1上调1.3倍,miR-328仅上调1.6倍,提示miR-1和miR-328可能是介导心肌损伤的关键miRNA;(2)应用H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型对miR-1和miR-328进行的功能学研究(MTT法,hoechst染色、Tunnel染色,LDH检测)显示,转染miR-1和miR-328可加重H2O2诱导的心肌损伤,转染miR-1和miR-328的特异性拮抗剂AMO-1、AMO-328可抑制H2O2诱导的心肌损伤,说明miR-1和miR-328是介导心肌损伤的关键因子,应用AMO-1、AMO-328对抗内源性miR-1和miR-328的功能可发挥心肌保护作用；(3)Western blot结果显示miR-1下调热休克蛋白60(HSP60)和热休克蛋白70(HSP70)的表达,miR-328可下调小窝蛋白-3(Caveolin-3,Cav3)和缝隙连接蛋白-43(eonnexin43,Cx43)的表达,上述作用可被AMO-1和AMO-328拮抗。荧光素酶报告基因结果显示miR-1抑制HSP60、HSP70 3UTR嵌合体的荧光素酶活性,miR-328抑制Caveolin-3和Cx43 mRNA3’UTR嵌合体的荧光素酶活性。
结论：心肌缺血再灌注损伤可引起microRNA表达谱的改变,miR-1和miR-328是调节这一病理过程的关键microRNAs之一,过表达miR-1和miR-328可加重心肌损伤,对抗内源性mir-1和miR-328具有心肌保护作用,其作用机制与抑制HSP60、HSP70、Cav3和Cx43的蛋白表达有关。
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