论文部分内容阅读
第一部分99mTc标记HER2亲合体ZHER2:V2制备及体外结合特性的研究目的本研究将HER2亲合体ZHER2:342的N端用-AEN取代-VEN,并对C端用四个氨基酸-G（Gly）GGC（Cys）作为螯合剂修饰,形成新的HER2亲合体ZHER2:V2。应用配体交换法将99mTc标记该亲合体,制备亲合体分子影像探针99mTc-ZHER2:V2,分析其在体外与HER2受体的结合特性。方法应用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZHER2:V2（序列为:AENKFNKEMRNAYWEIALLPNLNNQQKRAFIRSLYDDPSQSANLLAE AKKLNDAQ）,并在其C末端连接4个氨基酸（-GGGC）,形成一个类似N3S结构的,能与99mTc进行强力螯合的短肽,再利用配体交换法标记99mTc。利用反相高效液相色谱法（reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）测定分子探针99mTc-ZHER2:V2的标记率与放射化学纯度。分析分子探针99mTc-ZHER2:V2的体外稳定性,以及在体外与HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞的结合力及滞留率。同时,在体外应用过量未标记99mTc的ZHER2:V2对HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞HER2受体进行预阻断,与未阻断（未饱和）组进行对照,探究分子探针99mTc-ZHER2:V2与HER2受体结合的靶向特异性。结果分子探针99mTc-ZHER2:V2的放射峰是单峰,放射峰保留时间约为12min,标记20min后标记率为98.99%±0.99%（n=6）。99mTc-ZHER2:V2与生理盐水及人新鲜血清混合后在8h内的放化纯均在96%以上,且放射峰位置均较稳定。99mTc-ZHER2:V2在体外与HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞具有较高的结合率,24h最高,结合率为6.15%±0.18%。99mTc-ZHER2:V2在细胞内滞留率相对较高,最高可达75.26%±3.25%,经过24h后,仍有35.16%±11.23%滞留在细胞中,说明该分子探针可被HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞高摄取,并能长时间滞留在细胞中。随着时间延长细胞膜结合率整体呈曲线下降趋势,但经过24小时后,仍有近70%的99mTc-ZHER2:V2结合在细胞膜上。这表明99mTc-ZHER2:V2可与细胞膜上的HER2受体结合并转入细胞内,但这是一个很缓慢的过程。此外,分别加入500倍过量和1000倍过量未标记的ZHER2:V2对人卵巢癌SKOV3肿瘤细胞HER2受体进行阻断,分子探针与人卵巢癌SKOV3细胞的结合率随阻断倍数的增加而减小,分别为1.33%±0.21%和0.94%±0.13%,表明分子探针99mTc-ZHER2:V2与HER2受体的结合具有特异性。第二部分99mTc标记HER2亲合体ZHER2:V2体内分布及显像研究目的本研究将对分子探针99mTc-ZHER2:V2在HER2高表达人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠进行体内分布的研究,同时对该分子探针在HER2高表达人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠的显像,并与HER2低表达人乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠的显像进行对比研究。方法应用贴壁法培养HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞以及HER2低表达的人乳腺癌MCF-7细胞。裸鼠右前肢外侧皮下接种5×106个人卵巢癌SKOV3细胞或人乳腺癌MCF-7细胞,制备HER2高表达和低表达的移植瘤动物模型。34周后待移植瘤直径长至1.52.0cm,选取瘤体饱满、无坏死、大小无显著性差异的荷瘤裸鼠模型纳入实验。再选取16只移植瘤大小无明显差异的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠,随机分成4组,每只荷瘤裸鼠均经由尾静脉注射分子探针99mTc-ZHER2:V2。分别于注药后的第1h、2h、4h和6 h随机取1组裸鼠,麻醉后经眼静脉取血,并颈椎脱臼处死。解剖出心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、脑、肌肉、骨骼及肿瘤组织,分别称重,并且测定每个组织的放射性计数。计算每克组织的百分注射率即%ID/g,及肿瘤与对侧肌肉组织的%ID/g比值（tumor to muscle,T/M）。分析随时间变化分子探针99mTc-ZHER2:V2在人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠体内的代谢情况,以及荷瘤裸鼠体内不同器官（或组织）中的放射性分布情况。随机抽取移植瘤大小无明显差异的5只HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠及5只HER2低表达的人乳腺癌MCF-7细胞荷瘤裸鼠,将分子探针99mTc-ZHER2:V2经由尾静脉注射至荷瘤裸鼠体内。分别于注药后1h、2h、4h、6h和8 h进行显像,观察分子探针99mTc-ZHER2:V2在移植瘤内的浓聚情况,分别计算荷瘤裸鼠在不同时间点移植瘤与同等大小的对侧区域的放射性计数比值,即T/NT比值。对99mTc-ZHER2:V2在HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠及HER2低表达的人乳腺癌MCF-7细胞荷瘤裸鼠的体内显像差异进行对比分析。另取5只人乳腺癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠模型,每只荷瘤裸鼠经由尾静脉注射过量未标记99mTc的HER2亲合体ZHER2:V2使移植瘤组织HER2的受体封闭,5min后再注射分子探针99mTc-ZHER2:V2,按上述显像方法于注药后4h进行显像,对阻断组与非阻断组荷瘤裸鼠移植瘤部位放射性浓聚情况进行对比观察,并分析分子探针99mTc-ZHER2:V2与人卵巢癌SKOV3细胞移植瘤的HER2受体的体内特异性靶向结合特性。探讨分子探针99mTc-ZHER2:V2在活体内探测病灶HER2表达的应用价值。结果1.HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞移植瘤对99mTc-ZHER2:V2的体内摄取随注射时间延长而升高,且在6h达到高峰,为9.38±1.22%ID/g,表明99mTc-ZHER2:V2在人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠的移植瘤组织中的分布随时间增长而逐渐增加。以6h为例,移植瘤部位与对侧肌肉部位T/M值约为14.31±3.16,表明移植瘤对分子探针99mTc-ZHER2:V2摄取较高。除移植瘤以外,分子探针99mTc-ZHER2:V2在肾脏中的放射性分布最高,而肝脏中的放射性分布明显比肾脏低,在心脏、骨骼、肺脏和肌肉组织内放射性分布非常低,血液内的放射性亦较低,表明分子探针99mTc-ZHER2:V2大部分经肾脏代谢,而肝脏摄取率低,且探针血液清除快。2.HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠经由尾静脉注射分子探针99mTc-ZHER2:V2后1h显像时即可看到移植瘤部位显影,并且随着显像时间延长,放射性浓聚程度逐渐增加。除肿瘤以外,双侧肾脏和膀胱有明显的放射性浓聚,然而在甲状腺、肝脏等部位却始终未见明显的放射性浓聚,利用ROI技术测得的T/NT值以8h最高为14.13±1.22,这样的结果能够证明分子探针99mTc-ZHER2:V2体内稳定性较好,而且主要经肾脏排泄。3.对HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠提前注射过量未标记99mTc的ZHER2:V2,使HER2受体封闭后再行SPECT显像,未看到移植瘤组织明显摄取分子探针99mTc-ZHER2:V2,这表明未标记的ZHER2:V2可将人卵巢癌SKOV3细胞移植瘤组织的HER2受体封闭,分子探针99mTc-ZHER2:V2与人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠的移植瘤在体内具有HER2靶向结合特性。4.对HER2低表达的人乳腺癌MCF-7细胞荷瘤裸鼠注射99mTc-ZHER2:V2后,分别于不同时间点显像,可见只有双侧肾脏及膀胱可见明显的放射性浓聚,各时间点移植瘤所在部位均未见明显放射性浓聚,T/NT比值均明显低于HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠,各时间点均有显著性差异（t值分别为23.595,38.678,14.44,12.00,12.80,P值分别为0.000,0.000,0.000,0.000,0.000）。再次证明分子探针99mTc-ZHER2:V2在活体内可被HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞移植瘤摄取。第三部分99mTc标记HER2亲合体ZHER2:V2显像监测HER2阳性肿瘤早期疗效的研究目的本研究将探讨分子探针99mTc-ZHER2:V2 SPECT显像对化疗联合赫赛汀靶向治疗HER2高表达肿瘤疗效评价的价值。方法实验随机共分两组,每个治疗组荷瘤裸鼠3只。治疗组1（化疗组）:分别于治疗的第1d、4d、8d、11d,腹腔注射顺铂3mg/kg,紫杉醇20mg/kg;治疗组2（化疗联合靶向治疗组）:于治疗的第1d、4d腹腔注射顺铂3mg/kg,紫杉醇20mg/kg,并于第8d,腹腔注射赫赛汀40mg/kg。治疗期间,每3d测定荷瘤裸鼠的体重、移植瘤体积。利用游标卡尺测量移植瘤的最长径（L）及最短径（D）,移植瘤体积按如下公式计算:肿瘤体积=L×D2×1/2。分别于治疗前、治疗第8d、15d对各组荷瘤裸鼠进行99mTc-ZHER2:V2SPECT显像。经尾静脉注射分子探针99mTc-ZHER2:V24h后上机检查,取仰卧位扫描。观察各组人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠移植瘤的放射性浓聚情况。同时利用感兴趣区技术（Region of Interest,ROI）,分别对两个治疗组荷瘤裸鼠移植瘤与同等大小对侧区域的放射性计数的比值进行计算,即T/NT（target to nontarget）比值,并对两个治疗组进行对比分析。于治疗的第15d SPECT显像结束后,处死各组荷瘤裸鼠。取出移植瘤组织,观察移植瘤的大体形态,并进行免疫组化分析,观察移植瘤组织经治疗后对HER2的表达情况。最后分析分子探针99mTc-ZHER2:V2SPECT显像评价化疗联合赫赛汀治疗HER2高表达肿瘤疗效的临床价值。结果治疗结束后,两个治疗组荷瘤裸鼠体重经统计学分析,无显著性差异（F=0.579,P=0.689;F=0.462,P=0.762）,表明化疗或者化疗联合靶向治疗对荷瘤裸鼠的体重增长与否无明显影响。在前7d的治疗中,两个治疗组荷瘤裸鼠的移植瘤体积逐渐增大,治疗7d结束后,两治疗组荷瘤裸鼠移植瘤体积无显著性差异（t=0.165,P=0.877>0.05）;在后8d的治疗中,治疗组2中的荷瘤裸鼠的移植瘤体积逐渐缩小,而治疗组1的移植瘤体积仍然继续增大。治疗结束后,治疗组2中的荷瘤裸鼠的移植瘤体积明显小于其治疗组1（t=18.318,P=0.000<0.05）。这样的结果可以说明:化疗在联合应用HER2靶向药物后,可缩小移植瘤的体积,以达到治疗最佳的目的。治疗组1及治疗组2的HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠分别于治疗前、治疗后第8d、15d进行99mTc-ZHER2:V2SPECT显像。治疗前,各组HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤部位均可见放射性浓聚。经治疗后,治疗组1移植瘤部位放射性浓聚先减轻（治疗前7d）后增强（治疗后8d）;治疗组2移植瘤部位放射性浓聚逐渐减轻。治疗前,两个治疗组荷瘤裸鼠移植瘤部位T/NT比值无明显统计学差异（t=1.518,P=0.204>0.05）;经前7d治疗后,治疗组1和治疗组2荷瘤裸鼠肿瘤部位T/NT比值明显减小。在后8d治疗中,治疗组2荷瘤裸鼠移植瘤部位T/NT比值继续减小,治疗组1荷瘤裸鼠移植瘤部位T/NT比值较治疗前7d有所增加。当治疗结束后,两个治疗组荷瘤裸鼠移植瘤部位T/NT比值相比,有统计学差异（t=7.962,P=0.001<0.05）。且治疗组2荷瘤裸鼠移植瘤部位T/NT比值低于治疗组1。治疗组1及治疗组2的HER2高表达人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠经治疗后移植瘤组织的免疫组织化学分析:治疗组1可见中等程度的棕黄色染色;治疗组2可见仅有极少程度的棕黄色染色。结果表明,化疗联合HER2靶向治疗可以有效的降低HER2的表达水平。同时也证明了分子探针99mTc-ZHER2:V2可以作为监测肿瘤治疗早期疗效的显像剂。结论1.本研究中成功制备了核素99mTc标记的HER2亲合体ZHER2:V2。分子探针99mTc-ZHER2:V2的标记率高,标记方法简单易行,无需纯化;其体外稳定性好,可在体外与HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞的HER2受体特异性结合,并且长时间滞留在细胞中,99m9m Tc-ZHER2:V2是一个很有潜力的分子影像探针。2.分子探针99mTc-ZHER2:V2的体内分布特性良好,HER2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠的移植瘤部位摄取明显,大部分经肾脏排泄,肝脏摄取少,血液清除快,图像质量较高。分子探针99mTc-ZHER2:V2在体内与人卵巢癌SKOV3细胞荷瘤裸鼠移植瘤的HER2受体具有良好的靶向结合特性。分子探针99mTc-ZHER2:V2在活体内可探测病灶的HER2表达。3.赫赛汀联合化疗比单一的化疗对HER2高表达的人卵巢癌SKOV3移植瘤更具有明显治疗疗效,并且能显著缩小肿瘤体积,明显下调肿瘤组织HER2的表达水平。分子探针99mTc-ZHER2:V2可监测其治疗效果。