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再狭窄是316L不锈钢冠状动脉支架手术后面临的主要问题,而血栓和内膜平滑肌细胞的过度增生是导致再狭窄的根本原因。抗增生药物涂层支架由于能够有效地抑制平滑肌细胞的过度增生而使再狭窄得到一定程度的控制,因而在临床上得到了应用。然而,由于药物作用缺乏选择性,药物支架在抑制平滑肌细胞增生的同时在一定程度上延缓了支架表面的内皮化进程,从而导致了支架的再狭窄。同时,药物涂层支架存在着严重的后期血栓问题。因此,再狭窄仍然是316L不锈钢冠状动脉支架所面临的主要挑战。
原位诱导支架表面内皮化不仅能够防止支架表面血栓的形成,而且可以抑制再狭窄的发生,为彻底解决支架植入后的再狭窄问题提供了新的思路和手段。本研究在前期研究工作的基础上,将药物涂层支架和内皮化支架的优点有机结合起来,在316L不锈钢冠状动脉支架表面制备聚合物涂层,作为抑制平滑肌细胞增生药物或促进内皮细胞增生药物的载体,降低金属支架的血栓源性和血液对支架的腐蚀,同时作为连接介质,将促进内皮细胞粘附、增殖的生物活性分子固定到涂层表面,降低支架表面血栓的形成,同时加快内皮细胞的粘附和生长,以期加速支架表面的内皮化。
以支架表面常用聚合物材料EVAL、EVA及其水解产物等为研究对象,研究并优化了不锈钢表面制备涂层的工艺条件。研究不同聚合物材料对涂层的形貌、力学性能、涂层与不锈钢基体的结合强度、药物的释放能力等的影响。结果表明真空度对涂层的形貌有着决定性影响,在60℃真空条件下制备的涂层均匀、致密。与EVAL相比,采用EVA及系列水解产物制备的涂层韧性更好,涂层不容易破裂,而且EVA同316L不锈钢基体的结合强度更大,对药物释放的控制能力更强,是支架表面理想的涂层材料。
分别采用共价接枝、等离子体接枝、紫外接枝等方法将肝素固定到EVA涂层表面,研究了不同工艺条件对肝素接枝量以及EVA涂层表面血栓和细胞行为的影响。采用共价接枝方法在水解的EVA表面接枝肝素,随着醇解度和肝素浓度的增大,肝素接枝量均增加,但醇解度不能过大。采用等离子体接枝技术,以PEG为扩展臂在涂层表面接枝肝素。扩展臂对肝素接枝量无明显影响；随着处理时间延长,涂层表面肝素固定量增加。采用紫外接枝方法,以丙烯酸分子为“化学桥”,通过EDAC耦合将肝素分子固定到涂层表面。适当的单体浓度及紫外照射时间均会提高肝素的接枝率。采用三种方法接枝肝素后,涂层溶血率降低、凝血时间延长、血小板粘附降低,血液相容性提高,同时涂层表面细胞的活性增加,细胞相容性得到改善。相比之下,共价接枝易使肝素失去活性,同时影响材料的本体性能；紫外接枝方法反应难以控制,易于发生自聚等副反应；而等离子体接枝方法简便易行,不会影响涂层本体性能,对活性分子的影响也较小,是EVA表面活性分子固定的理想方法。
以PEG为扩展臂,分别采用等离子体液相和气相接枝技术将合成的仿生海洋生物多肽固定到EVA涂层表面,并采用体外细胞培养技术测试了合成多肽的细胞毒性。结果表明在多肽浓度小于50μg/ml时,细胞的生长不会受到明显影响,但浓度过大对细胞的扩展有一定的抑制作用。将多肽固定到涂层表面,液相接枝的效果好于气相接枝。涂层接枝多肽后,亲水性提高、血小板粘附降低、血小板无聚集,同时涂层表面细胞的粘附增多、增殖加快、活性提高,细胞在涂层表面的结合力增强。适当的接枝时间会提高接枝效果,使涂层表面的细胞具有较高的活性。扩展臂的分子量以及接枝时间对细胞的活性有一定的影响。以PEG400作为扩展臂,细胞的活性最高,PEG接枝达到10min后,细胞活性变化不再明显。多肽接枝时间为10min时,细胞活性最大。
分别采用粘性多肽共吸附和等离子体液相接枝技术将对内皮细胞表面抗原特异结合的CD34抗体接枝到EVA涂层表面,研究了不同方法和工艺的影响规律。粘性多肽共吸附过程中,适当提高多肽浓度,可以有效地促进细胞的粘附,但浓度过高,反而会抑制细胞的粘附；抗体的固定量随着抗体浓度的增加而增加,涂层表面细胞的粘附也相应增加,细胞增殖加快、活性提高。采用等离子接枝技术固定到涂层表面的抗体保持了较高的活性,接枝抗体后,涂层表面血小板粘附降低,血液相容性提高。同时细胞的粘附增加,增殖加快,活性提高,细胞同涂层的结合力加强。适当增加抗体的接枝时间可以增加抗体的接枝量,并能保持抗体的活性。当PEG及抗体的接枝时间都为10min时,涂层表面细胞的活性较大。样品的紫外照射消毒时间对CD34抗体活性有较大影响,消毒时间越长,抗体活性损失越大,细胞的活性越低。
分别采用粘性多肽共吸附和位点固定方法,将CD34抗体固定到316L不锈钢片及不锈钢支架表面。在粘性多肽共吸附中,提高多肽浓度,可以促进细胞的粘附,但浓度过高,反而抑制了细胞的粘附。提高抗体浓度,被固定的抗体量增加,细胞的粘附增加。钢片固定多肽及抗体后,细胞增殖加快,细胞活性增加,细胞与基体的结合强度提高。采用位点固定方法,保持了抗体的活性。适当延长硅烷化时间、抗体接枝时间、提高抗体浓度都可以增加抗体的接枝量,进而改善细胞的粘附。不锈钢表面接枝抗体后,凝血时间延长,血小板粘附降低,表明不锈钢的血液相容性提高。同时细胞增殖加快,细胞活性提高,细胞与不锈钢的结合力加强。进一步采用物理吸附方法和位点固定方法在316L不锈钢支架表面固定CD34抗体并放入细胞悬液中培养,初步实验结果表明,抗体的固定增加了细胞的粘附和增殖,提高了内皮修复的速度。