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研究背景和研究目的非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是指由组织学或影像学判定肝脏脂肪堆积（大于等于5%肝）并且不存有其他引起肝脏脂肪变性的因素:病毒性肝炎、大量饮酒、药物或遗传性疾病等的临床病理综合征,包括脂肪肝变性、脂肪性肝炎、肝硬化等一系列疾病进程。在脂肪肝变性阶段,肝细胞质中形成脂滴,导致细胞肿大,这一阶段是NAFLD的最早阶段,并呈可逆状态。肝脏中脂质堆积的主要影响因素包括:脂质的合成、脂肪酸氧化以及脂肪酸氧化过程中产生的氧化应激。随着现代生活方式的改变,NAFLD的发病率在全球范围内迅速增长,达到17%-33%,在我国NAFLD已经高居城市男性高发疾病首位,近年,NAFLD和NASH的发病率分别为46%和12%,非酒精性脂肪肝相关的肝硬化疾病呈上升趋势,而且大部分发生在中年人群中。而NAFLD的发病机制并未完全确定,并且在药理学上尚无共识治疗手段。生活方式的干预包括运动训练,是防治NAFLD的核心疗法。运动可降低NAFLD患者肝内脂质含量和肝细胞损伤标志物,这一保护机制包含多个方面:血脂和脂蛋白含量、胰岛素代谢、肝纤维化、炎症等的有力改变,但是关于有氧运动促进NAFLD良性转归的细胞和分子机制少见。黑果枸杞味甘、性平,富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、生物碱、矿物质、微量元素等多种营养成分,更含有丰富的具有清除自由基、抗氧化功能的黑果色素-天然原花青素。现代医学研究已经证实,黑果枸杞活性成分可提升小鼠抗疲劳能力、降低血糖、促进机体自由基清除能力、降低高血脂症及脂质过氧化程度。但是有氧运动与黑果枸杞活性成分补充联合应用改善NAFLD肝脏脂质蓄积的研究较少,具体机制尚不明确,有待进行系统的研究。黑果枸杞活性成分主要包括:多糖、色素和黄酮,我们通过有氧运动与各黑果枸杞活性成分单独干预和有氧运动与多糖、有氧运动与色素、有氧运动与黄酮补充联合干预NAFLD小鼠,检测NAFLD小鼠在脂质合成（SREBP-1c途径）、脂肪酸氧化（PPARα途径）关键信号通路相关因子表达水平的改变以及机体氧化应激水平,探究有氧运动与黑果枸杞活性成分补充对NAFLD的干预效果、联动效应及可能机制。硫化氢（H2S）是最新发现的气体信号分子,内源性H2S在肝脏生理及病理过程中起着重要作用,如保护线粒体功能、抗氧化应激、抗炎症、促进血管生成、保护血压等。运动对H2S信号分子的研究较少,少量几篇主要是关于心肌内质网应激、肺组织纤维化通路、改善高血压大鼠内皮功能以及运动可能通过提高高脂饮食喂养小鼠肝脏中H2S合成和利用率,进而促进肝脏脂质自噬。最新研究发现,H2S通过调控SREBP-1c信号通路影响肝脏脂质合成,这与有氧运动干预NAFLD的可能途径相一致。我们猜测,有氧运动可能对NAFLD小鼠肝脏中内源性H2S的合成有着重要的调节作用,并且有氧运动通过影响肝脏中H2S含量,调控NAFLD小鼠肝脏脂质合成是有氧运动干预NALFD的主要机制之一。为了验证这一猜测,我们采用有氧运动、肝脏生成H2S关键基因CSE抑制剂PAG、外源性H2S补充物NAHS单独干预和有氧运动与PAG、有氧运动与NAHS联合干预NAFLD小鼠,检测NAFLD小鼠肝脏中H2S含量、主要H2S调控基达,探讨有氧运动促进NAFLD良性转归的相关机制。方法:第一部分:构建高糖高脂膳食诱导NAFLD模型营养诱发动物模型（食物喂养法）是构建NAFLD动物模型建立最常用的方法,采用高糖高脂乳剂灌注诱导NAFLD模型,模型构建完成后观察肝脏病理损伤及肝功能指标的改变。第二部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD效果给与NAFLD模型小鼠7周中等强度有氧运动(76%VO2max)与黑果枸杞多糖、色素、黄酮单独和联合干预:模型组（MX）、有氧运动组（E）、黑果枸杞多糖组（P）、黑果枸杞色素组（C）、黑果枸杞黄酮组（F）、有氧运动联合黑果枸杞多糖组（EP）、有氧运动联合黑果枸杞色素组（EC）、有氧运动联合黑果枸杞黄酮组（EF）,观察肝脏病理损伤、肝脏脂质沉积、肝功能损伤指标;观察氧化应激相关指标。第三部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD脂质合成关键信号转导途径的研究给与NAFLD模型小鼠7周有氧运动与黑果枸杞多糖、色素、黄酮单独和联合干预,观察脂质合成关键信号通路（SREBP-1c途径）相关因子基因表达和蛋白阳性表达。第四部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD脂肪酸氧化关键信号转导途径的研究给与NAFLD模型小鼠7周有氧运动与黑果枸杞多糖、色素、黄酮单独和联合干预,观察调控脂肪酸氧化（线粒体β氧化、微粒体ω氧化和过氧化酶体β氧化）过氧化物酶体增殖物激活α受体（PPARα）通路相关因子的基因表达和蛋白阳性表达;观察线粒体β氧化速率。第五部分:有氧运动对H2S的影响及有氧运动干预NAFLD脂质合成的作用机制研究给与NAFLD模型小鼠7周有氧运动与CSE基因抑制剂PAG、外源性H2S补充物NAHS单独和联合干预:空白对照组（KB）、模型组（MX）、有氧运动组（E）、CSE基因抑制剂PAG组（Pa）、外源性H2S补充物NAHS组（Na）、有氧运动联合PAG组（EPa）、有氧运动联合NAHS组（ENa）,观察肝脏病理损伤;观察外周血、肝组织H2S含量和肝脏脂质沉积;观察H2S生成主要调控因子CSE、CBS基因表达;观察脂质合成关键信号通路（SREBP-1c途径）相关因子基因表达和蛋白阳性表达。结果第一部分:构建高糖高脂膳食诱导NAFLD模型高糖高脂膳食灌注诱导NAFLD模型7周。1.一般情况:高糖高脂膳食诱导NFALD模型组小鼠体重、肝脏湿重、肝指数较正常组小鼠更高（P<0.01）。2.病理检测:HE染色见正常对照组小鼠,肝小叶结构完整,肝索排列整齐,肝细胞大小较为均匀,胞质中少见脂性空泡,细胞核圆,居中。模型组小鼠肝脏肝小叶结构紊乱,肝索排列紊乱,细胞中出现大量脂性空泡,肝细胞膨大,细胞核形变并出现在细胞周边,汇管区出现少量炎性浸润区域。3.肝脏损伤指标:模型组小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性升高,总甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）含量升高,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）含量显著下降。第二部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD效果NAFLD模型建立,给与7周有氧运动与黑果枸杞活性成分单独和联合干预。1.一般情况:与MX组相比,黑果枸杞活性成分单独干预组小鼠体重没有改变,肝湿重下降,肝指数下降（P<0.01）,E、EF、EC、EP组小鼠体重降低,肝湿重下降,肝指数下降（P<0.05或P<0.01）,有氧运动与黑果枸杞活性成分联合干预对肝脏湿重存在协同效应。2.病理检测:与模型组相比,各干预组小鼠肝索排列较完整,部分肝细胞中存有小泡样脂滴,肝细胞浊肿减少,脂质变性程度减轻,有氧运动与黑果枸杞各活性联合干预对脂质变性改变存在协同效应。3.脂质沉积相关指标:与模型组相比,各干预组小鼠肝实质细胞中TG,血液TG、TC含量显著降低（P<0.01）,有氧运动与黑果枸杞各活性联合干预对肝脏TG、血液TG、TC含量存在协同效应。4.肝损伤相关指标:与MX组相比,各干预组小鼠血清ALT、AST活性及LDL-c含量下降,HDL-c含量升高（P<0.01）,有氧运动与黑果枸杞多糖协同影响AST活性;有氧运动与黑果枸杞色素、黄酮对于ALT、AST活性有协同效应;对于HDL-c含量,有氧运动与黑果枸杞各活性成分间存在协同效应,对于LDL-c含量,有氧运动与黑果枸杞多糖、色素间存在协同效应。5.氧化应激相关指标:与MX组相比,各干预组脂质过氧化产物（TBARS）含量降低,肝脏中GSH含量、SOD活性上升（P<0.05或P<0.01）。对于SOD活性和GSH含量,有氧运动与黑果枸杞色素、黄酮间存在协同效应;对于TBARS含量,有氧运动与黑果枸杞多糖、色素间存在协同效应。第三部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD脂质合成关键信号转导途径的研究肝脏脂质合成关键信号通路（SREBP-1c途径）相关因子的表达水平:与MX组相比,各干预组肝脏脂质合成代谢中调控基因LXRα、SREBP-1c、TNF-a基因和蛋白表达均显著下调,下游相关靶基因乙酰CoA羧化酶（ACC）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD1）、脂肪酸合成酶（FAS）mRNA基因表达下降,C、EC组Insig-1表达水平没有显著性改变,P、EP组胰岛素诱导基因（Insig-1）基因和蛋白表达均下降,F组Insig-1基因表达没有改变,蛋白表达下降。对于LXRα基因表达,有氧运动与黑果枸杞多糖、黄酮间存在协同效应;对于ACC基因表达,有氧运动与黑果枸杞活性成分间存在协同效应;对于SCD1基因表达,有氧运动与黑果枸杞多糖间存在协同效应。对于TNFα蛋白阳性表达,有氧运动与黑果枸杞各活性成分间存在协同效应。第四部分:7周有氧运动与黑果枸杞活性成分干预NAFLD脂肪酸氧化关键信号转导途径的研究1.线粒体是脂肪酸氧化的主要场所,肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ（CPT1）、长链乙酰辅酶脱氢酶（LCAD）是PPARα调控线粒体脂肪酸氧化的主要靶基因。给与7周有氧运动与黑果枸杞枸杞活性成分单独和联合干预,与MX组相比,P组肝脏PPARα基因表达和蛋白表达、CPT1、LCAD基因表达均无显著性差异,E、EP、EC、EF、C、F组PPARαmRNA表达、蛋白表达上调,下游基因LCAD、CPT1 mRNA表达上调（P<0.05或P<0.01）。有氧运动与黑果枸杞多糖协同作用与PPARα基因表达、蛋白表达以及LCAD基因表达。2.过氧化酶体β氧化和微粒体ω氧化是脂肪酸氧化的次要代谢途径,细胞色素P4502E1（CYP2E1）、细胞色素4A10（CYP4A10）、细胞色素4A12（CYP4A12）是微粒体ω氧化关键酶,酞基辅酶A氧化酶（AOX）是过氧化酶体β氧化限速酶,PPARα转录调节编码上述脂肪酸代谢酶的基因。给与7周有氧运动与黑果枸杞枸杞活性成分单独和联合干预,与MX组相比,P组CYP2E1基因表达、蛋白表达均无显著差异,AOX、CYP4A10、CYP4A12基因表达没有显著差异,E、EP、EC、EF、C、F组CYP2E1 mRNA表达、蛋白表达上调,下游基因CYP4A12、CYP4A10 mRNA表达上调（P<0.05或P<0.01）。有氧运动与黑果枸杞色素协同作用与CYP4A10基因表达。3.线粒体β氧化速率:给与7周有氧运动与黑果枸杞枸杞活性成分单独和联合干预,与MX组相比,各干预组线粒体β氧化速率上升,促进脂质的β氧化,降低肝脏脂质堆积。有氧运动与黑果枸杞多糖、色素对线粒体β氧化速率在协同作用。第五部分:有氧运动对H2S的影响及有氧运动干预NAFLD脂质合成的作用机制研究1.胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）基因抑制剂PAG干预对H2S生成及SREBP-1c信号通路相关因子表达的影响:7周高糖高脂膳食灌注显著降低肝脏中CSE基因表达、上调胱硫醚-β-合酶（CBS）基因表达,降低组织及外周血H2S含量,上调肝脏SREBP-1c信号通路相关因子表达水平,CSE抑制剂对小鼠肝脏CSE基因的过表达率约为-73.43%,对NAFLD小鼠体重、CBS基因表达无显著影响,显著提高肝脏湿重及肝指数、肝脏中TG含量,HE染色及超微电镜显示进一步的肝脏损伤;与Pa相比,有氧运动联合PAG一定程度促进CBS基因表达、降低肝指数,提高肝脏H2S含量,降低肝组织SREBP-1c信号通路相关因子表达水平;与有氧运动组相比,EPa组仍显示更高的小鼠体重、肝湿重、肝TG含量及ACC、SCD1基因表达水平,有氧运动与PAG之间对于肝指数、肝脏中H2S含量及FAS基因表达水平显示拮抗效应,有氧运动与PAG对小鼠体重显示协同效应。2.外源性H2S补充物NAHS干预对H2S生成及SREBP-1c信号通路相关因子表达的影响:外源性补充NAHS对NAFLD小鼠CSE、CBS基因表达无显著差异,显著降低肝脏体重、肝湿重、肝脏TG含量及肝细胞损伤,有效提高肝脏及外周血H2S含量,降低肝脏中SREBP-1c信号通路相关因子表达水平;ENa较E组、Na组显示出更高的CBS基因表达水平及更低的体重、肝指数、肝脏中TG含量、SREBP-1c相关因子表达水平及更高的H2S含量,有氧运动与NAHS对组织中H2S含量、SREBP-1c、FAS基因表达显示协同效应。结论本课题探索了有氧运动与黑果枸杞活性成分补充干预NAFLD的效果及可能调控途径以及有氧运动干预NAFLD的分子机制:1.7周有氧运动与黑果枸杞活性成分通过调控SREBP-1c信号途径抑制NAFLD小鼠肝脏脂质合成,有氧运动与黑果枸杞活性成分联合干预脂质合成效果优于单独干预。2.7周有氧运动与黑果枸杞色素、黄酮通过调控PPARα信号途径促进NAFLD小鼠肝脏脂肪酸氧化,黑果枸杞多糖对脂肪酸氧化的干预效果有限。有氧运动与黑果枸杞活性成分联合干预脂肪酸氧化效果优于单独干预。3高糖高脂膳食灌注引起肝脏脂质蓄积损伤与H2S信号传递因子有关,有氧运动与外源性添加NAHS有利于降低这种损伤,PAG抑制剂会促进损伤进一步加剧;有氧运动通过H2S信号因子,调控SREBP-1c信号通路相关因子表达,抑制NAFLD小鼠肝脏脂质合成。