论文部分内容阅读
目的:分离鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)临床株,分析其细胞毒素相关基因A蛋白(Cytotoxinassociated gene A protein,CagA)磷酸化基序EPIYA的结构特点,比较H.pylori东亚株和西方株CagA蛋白的结构差异,初步探讨东亚型和西方型CagA对细胞增殖与凋亡的影响。方法:选取胃相关疾病患者的胃黏膜组织,剪碎后接种于哥伦比亚血琼脂平板,微需氧培养,菌落生长后通过尿素酶试验、革兰染色及显微镜检查对H.pylori进行初步鉴定。提取菌落基因组,PCR扩增H.pylori 16S rRNA基因并进行测序鉴定;扩增cagA基因全长序列,连接入pMD18-T载体,将重组载体转入感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α,挑起阳性克隆,测序鉴定;利用DNAStarV7.1和MEGA 6软件对cagA序列进行比对及聚类分析。应用多个生物数据库和多种生物学软件对H.pylori CagA蛋白进行信息学分析;将东亚、西方型全长cagA基因定向克隆入pcDNA3.1真核表达载体,获得的阳性克隆测序鉴定后转染胃癌细胞株MKN-45,通过流式细胞术检测CagA对细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功分离H.pylori临床株共26株;构建pMD18-T/cagA克隆载体后对26株H.pylori的cagA基因全长测序,序列比对分析显示有6株为西方型,20株为东亚型。东亚型CagA第815~834位点存在13个氨基酸的缺失、部分缺失或变异,西方型中有3株丢失磷酸化位点EPIYA-C;聚类分析显示H.pylori分离株分别聚类为东亚群、西方型东亚群以及西方群3群,与东亚国家日本菌株的同源性最高,共同聚类于东亚群。选取CagA/GZ7(典型东亚株)和CagA/26695(典型西方株)进行理化特性分析和空间构像预测,结果显示CagA/26695有1184个氨基酸,分子量为132.36kDa,等电点为8.93;CagA/GZ7有1175个氨基酸,分子量为131.32kDa,等电点为8.30;两种菌株的CagA蛋白空间结构较为相似,均为亲水性的稳定蛋白,位于胞质内,但其抗原肽段的位置、二级结构的组成及保守结构域在东亚型和西方型CagA之间存在差异。与对照组pcDNA3.1细胞比较,高表达cagA的细胞:pcagA/26695细胞组和pcagA/GZ7细胞组的凋亡百分率分别为8.29±0.61和9.98±1.07,均高于对照组细胞(5.38±0.61),差异有统计学意义(均P<0.01);虽然pcagA/GZ7细胞组的凋亡率稍高于pcagA/26695细胞组,但差异无统计学意义(P>0.05)。细胞周期结果显示:pcagA/26695细胞组和pcagA/GZ7细胞组G0-G1期细胞百分率均高于pcDNA3.1细胞组(百分率分别为36.14±3.16,36.56±1.62和30.88±1.03),差异有统计学意义(P<0.05);S期细胞均显著低于pcDNA3.1细胞组(百分率分别为48.57±2.90,48.01±2.22和54.57±1.52,P<0.05),而G2-M期细胞百分率在三组之间差异无统计学意义(百分率分别为15.29±0.43,15.42±0.59和14.55±0.88,P>0.05),各细胞周期的百分率在pcagA/26695细胞组和pcagA/GZ7细胞组之间也无显著差异。结论:H.pylori临床分离株以东亚株为主,但也存在西方株感染;东亚型和西方型CagA存在结构差异;临床分离株之间存在聚类关系,与日本株同源性较高;生物信息学预测东、西方型CagA在二级结构和保守结构域存在一定差异;CagA可抑制胃癌细胞的增殖、促进细胞凋亡,但东亚型与西方型CagA之间无显著差异。