论文部分内容阅读
目的：神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛。研究表明尽管应用强效的阿片类镇痛药物，但仍然有约半数的神经病理性疼痛患者疼痛程度没有得到缓解。研究报告，μ阿片受体在镇痛药物如吗啡的临床效应以及长时间和大量使用阿片类药物所引起的耐受和生理依赖的发生发展过程中均起着关键的作用。近些年，越来越多的证据证明，外周神经损伤后，脊髓以及背根神经节神经元(DRG)中μ阿片受体的表达水平降低。这就为吗啡在治疗神经病理性疼痛时镇痛效应降低提供了一个合理的解释。但是，具体的表达降低的位置仍然存在争议以及外周神经损伤后μ阿片受体动态变化的分子机制却并不清楚。有研究报道指出μ阿片受体基因受到DNA甲基化修饰的调控。本实验的目的旨在探讨外周神经损伤后μ阿片受体表达变化的具体位置以及DNA甲基化修饰调控是否参与了外周神经损伤引起的μ阿片受体的表达。 方法： 1、为观察全身应用吗啡对慢性神经病理性疼痛的镇痛效应，分别于慢性坐骨神经缩窄性损伤(CCI)模型建立后1d、3d、7d、14d腹腔注射3mg/kg吗啡，检测每次给药后30min时损伤侧的热缩足反射潜伏期;在模型建立以后7d腹腔给予Vehicle或1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg吗啡，检测每次给药后10min、20min、30min、40min、50min、60min时损伤侧的热缩足反射潜伏期。 2、为观察侧脑室、鞘内、外周应用吗啡对慢性神经病理性疼痛的镇痛效应，于模型建立后7d侧脑室给予Vehicle或0.05nmol、0.1nmol、0.5nmol吗啡，鞘内给予Vehicle或1nmol、5nmol、10nmol吗啡，足底给予Vehicle或10nmol、30nmol、100nmol吗啡，检测每次给药后10min、20min、30min、40min、50min、60min时损伤侧的热缩足反射潜伏期。 3、为观察外周神经损伤是否时间依赖性的降低背根神经节和脊髓中μ阿片受体mRNA的转录和蛋白的表达，采用RT-PCR、荧光实时定量PCR(qRT-PCR)和western blot方法检测模型前(0d)、模型建立后1d、3d、7d、14d背根神经节和脊髓中μ阿片受体mRNA的转录和蛋白的表达。 4、为观察外周神经损伤降低背根神经节胞体μ阿片受体蛋白的表达时是否同时降低其中枢端和外周端μ阿片受体蛋白表达，采用western blot和免疫组织化学方法检测模型建立后7d背根神经节、脊髓、坐骨神经和外周皮肤中μ阿片受体蛋白的表达。 5、为观察背根神经节μ阿片受体蛋白和mRNA表达的亚细胞定位，采用免疫组织化学和RT-PCR方法检测模型前背根神经节中μ阿片受体蛋白和mRNA在细胞内的分布。 6、为观察外周神经损伤是否时间依赖性的增加背根神经节μ阿片受体基因启动子的甲基化水平;为观察外周神经损伤引起背根神经节μ阿片受体基因启动子甲基化水平的增加是否引起μ阿片受体基因转录的降低。采用亚硫酸氢盐修饰后测序方法检测模型前(0d)、模型建立后1d、3d、7d背根神经节中μ阿片受体基因启动子的甲基化水平;采用RT-PCR方法检测模型建立后7d背根神经节中μ阿片受体基因不同启动子介导的mRNA的转录水平。 7、为离体观察μ阿片受体基因启动子甲基化水平是否程度依赖性的降低μ阿片受体基因启动子的活性，采用双荧光素酶报告基因分析方法检测经部分甲基化酶和完全甲基化酶修饰后，μ阿片受体基因启动子的活性。 8、为观察连续鞘内注射5-aza-dC是否剂量依赖性的改善外周、鞘内、全身应用吗啡对慢性神经病理性疼痛的镇痛效应，分别于模型建立后1d、3d、5d连续鞘内注射不同剂量的5-aza-dC(0.2、1、5μg)，于模型建立后7d足底注射30nmol、鞘内注射1nmol、腹腔注射1mg/kg吗啡，检测足底、鞘内给药后10min和腹腔给药后30min时损伤侧的热缩足反射潜伏期。为观察连续鞘内注射5-aza-dC是否改善外周、鞘内、腹腔应用吗啡对慢性神经病理性疼痛的镇痛效应，分别于模型建立后1d、3d、5d连续鞘内注射不同剂量的5-aza-dC(0.2、1、5μg)，于模型建立后7d足底给予Vehicle或3nmol、10nmol、30nmol吗啡，鞘内给予Vehicle或1nmol、5nmol、10nmol吗啡，腹腔给予Vehicle或1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg吗啡，检测每次给药后10min、20min、30min、40min、50min、60min时损伤侧的热缩足反射潜伏期。 9、为观察连续鞘内注射5-aza-dC是否剂量依赖性的降低外周神经损伤小鼠背根神经节和脊髓μ阿片受体基因启动子的甲基化水平;为观察连续鞘内注射5-aza-dC引起背根神经节μ阿片受体基因启动子甲基化水平的降低能否引起μ阿片受体基因转录的增加。分别于模型建立后1d、3d、5d连续鞘内注射不同剂量的5-aza-dC(0.2、1、5μg)，于模型建立后7d采用亚硫酸氢盐修饰后测序方法检测背根神经节和脊髓中μ阿片受体基因启动子的甲基化水平和采用RT-PCR方法检测背根神经节和脊髓中μ阿片受体基因不同启动子介导的mRNA的转录水平。 10、为观察连续鞘内注射5-aza-dC是否剂量依赖性的增加外周神经损伤小鼠背根神经节和脊髓中μ阿片受体mRNA的转录和蛋白的表达，分别于模型建立后1d、3d、5d连续鞘内注射不同剂量的5-aza-dC(0.2、1、5μg)，于模型建立后7d采用RT-PCR、qRT-PCR和westem blot方法检测背根神经节和脊髓中μ阿片受体mRNA的转录和蛋白的表达。 11、为观察连续鞘内注射5-aza-dC增加外周神经损伤小鼠背根神经节胞体μ阿片受体蛋白的表达的同时，是否增加其中枢端和外周端μ阿片受体蛋白表达，分别于模型建立后1d、3d、5d连续鞘内注射不同剂量的5-aza-dC(0.2、1、5μg)，于模型建立后7d采用western blot和免疫组织化学方法检测背根神经节、脊髓、坐骨神经和外周皮肤中μ阿片受体蛋白的表达。 结果： 1、对照组小鼠，腹腔注射吗啡1mg/kg和3mg/kg能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)，CFA小鼠，同样产生和对照组相同的镇痛效应（P＜0.05或P＜0.01)。CFA小鼠的剂量-镇痛效应曲线没有产生右移。假手术组小鼠，腹腔注射吗啡1mg/kg和3mg/kg能够产生显著地镇痛效应(P＜0.05），神经损伤小鼠，腹腔注射3mg/kg和10mg/kg才能产生显著地镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)，神经损伤小鼠的剂量-镇痛效应曲线产生明显的右移。 2、假手术组小鼠，侧脑室注射吗啡0.1nmol和0.5nmol能够产生显著的镇痛效应（P＜0.05），神经损伤小鼠，同样产生和对照组相同的镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)。神经损伤小鼠的剂量-镇痛效应曲线没有产生右移;假手术组小鼠，鞘内注射吗啡1nmol和5nmol能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05)，神经损伤小鼠，腹腔注射5nmol和10nmol才能产生显著的镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)，神经损伤小鼠的剂量-镇痛效应曲线产生明显的右移;假手术组小鼠，足底注射吗啡10nmol和30nmol能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05），神经损伤小鼠腹腔注射100nmol才能产生显著的镇痛效应(P＜0.05)，100mol吗啡产生全身效应，神经损伤小鼠的剂量-镇痛效应曲线产生明显的右移。 3、假手术组小鼠，脊髓和背根神经节中的μ阿片受体蛋白表达没有显著变化。神经损伤小鼠，神经损伤后μ阿片受体蛋白表达呈时间依赖性的降低并在第3、7、14天有显著的统计学差异(P＜0.05或P＜0.01);假手术组小鼠，脊髓和背根神经节中的μ阿片受体mRNA水平没有显著变化。神经损伤小鼠，背根神经节的μ阿片受体mRNA水平呈时间依赖性的降低(P＜0.05或P＜0.01)，但是脊髓中μ阿片受体mRNA水平没有显著变化。 4、与假手术组相比，western blot检测显示神经损伤小鼠的背根神经节、脊髓、坐骨神经和足底皮肤内的μ阿片受体表达降低（P＜0.05或P＜0.01）。免疫荧光检测显示神经损伤后第7天，背根神经节内的μ阿片受体阳性神经元数量较假手术组显著的降低(P＜0.05），假手术组μ阿片受体阳性神经元数量为58.4±5.67，而神经损伤组μ阿片受体阳性神经元数量为29.2±7.15，且大多数分布于中小直径的初级传入神经元;脊髓背角的μ阿片受体阳性神经元数量较假手术组显著的降低(P＜0.05)，假手术组μ阿片受体阳性神经元数量为40.8±6.22，而神经损伤组μ阿片受体阳性神经元数量为16.9±3.41，且大多数分布于脊髓背角的第I板层。假手术组，坐骨神经和足底皮肤内可以检测到μ阿片受体阳性神经纤维，神经损伤后则很少能检测到μ阿片受体阳性神经纤维。 5、μ阿片受体主要表达于无髓鞘的神经纤维C纤维中。在C纤维中，μ阿片受体主要与CGRP共表达，而很少与I34共表达。与双标免疫荧光结果相同的是，μ阿片受体mRNA在IB4阴性小直径神经元中的水平是最高的。 6、以ATG起始位点即0位点，μ阿片受体基因近端启动子区域，从-569到+33，包含有20个甲基化作用位点（CG位点）且都处于较低的甲基化状态。外周神经损伤后，背根神经节中μ阿片受体基因近端启动子区域的-388、-344和-255位点的甲基化水平呈时间依赖性的增加(P＜0.05或P＜0.01)。μ阿片受体基因远端启动子区域，从-1721到-780，包含有11个甲基化作用位点且都处于较高的甲基化状态，高于70％甚至达到100％。外周神经损伤后，背根神经节中μ阿片受体基因远端启动子区域中无一位点的甲基化水平有显著性的变化。外周神经损伤后，μ阿片受体近端启动子介导表达的mRNA水平较正常组显著的降低(P＜0.05)，而μ阿片受体远端启动子介导表达的mRNA水平较正常组没有显著的降低。 7、与没有经甲基化酶修饰的对照组相比，部分甲基化酶修饰引起荧光素酶的活性一定程度的降低(P＜0.05)，完全甲基化酶修饰则能够引起荧光素酶的活性几乎完全丧失（P＜0.01）。 8、连续鞘内注射5-aza-dc治疗神经损伤小鼠，足底注射30nmol吗啡、鞘内注射1nmol吗啡、腹腔注射1mg/kg吗啡剂量呈依赖性的镇痛增加(P＜0.05或P＜0.01)。神经损伤小鼠，足底注射吗啡10nmol和30nmol不能产生显著的镇痛效应，连续鞘内注射5-aza-dc治疗小鼠足底注射吗啡30nmol能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05)。剂量-镇痛效应曲线产生明显的左移;神经损伤小鼠，鞘内注射吗啡1nmol不能产生显著的镇痛效应，连续鞘内注射5-aza-dc治疗小鼠鞘内注射吗啡1nmol能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)。剂量-镇痛效应曲线产生明显的左移;神经损伤小鼠，腹腔注射吗啡1mg/kg不能产生显著的镇痛效应，连续鞘内注射5-aza-dc治疗小鼠腹腔注射吗啡1mg/kg能够产生显著的镇痛效应(P＜0.05或P＜0.01)。剂量-镇痛效应曲线产生明显的左移; 9、连续的鞘内注射5-aza-dC后，背根神经节中μ阿片受体基因近端启动子区域的-388、-344和-255位点的甲基化水平呈剂量依赖性的降低(P＜0.05）。背根神经节中μ阿片受体基因远端启动子区域中无一位点的甲基化水平有显著性的变化。μ阿片受体近端启动子介导表达的mRNA水平显著的增加(P＜0.05)，而μ阿片受体远端启动子介导表达的mRNA水平没有显著的降低。 10、神经损伤小鼠，神经损伤后第7天，脊髓和背根神经节中的μ阿片受体蛋白表达降低。5-aza-dC治疗后小鼠，μ阿片受体蛋白表达呈剂量依赖性的增加(P＜0.05);神经损伤小鼠，神经损伤后第7天，背根神经节中的μ阿片受体mRNA水平显著降低。5-aza-dC治疗后小鼠，背根神经节的μ阿片受体mRNA水平呈剂量依赖性的增加(P＜0.05)。 11、与神经损伤小鼠相比，western blot检测显示5-aza-dC治疗小鼠的背根神经节、脊髓、坐骨神经和足底皮肤内的μ阿片受体表达增加(P＜0.05或P＜0.01)。免疫荧光检测显示5-aza-dC治疗后，背根神经节内的μ阿片受体阳性神经元数量较假手术组显著的增加（P＜0.05），神经损伤组μ阿片受体阳性神经元数量为29.2±7.15，而5-aza-dC治疗组μ阿片受体阳性神经元数量为41.9±10.07;脊髓背角的μ阿片受体阳性神经元数量较假手术组显著的增加(P＜0.05），神经损伤组μ阿片受体阳性神经元数量为16.9±3.41，而5-aza-dC治疗组μ阿片受体阳性神经元数量为27.4±5.48。神经损伤组，坐骨神经和足底皮肤内很少能够检测到μ阿片受体阳性神经纤维，5-aza-dC治疗后则有μ阿片受体阳性神经纤维被检测到。 结论：本实验阐明，外周神经损伤后，背根神经节内的μ阿片受体基因受到DNA甲基化表观遗传学机制的基因沉默调控，从而引起吗啡在神经病理性疼痛中镇痛效应不好。消除这种神经损伤后的DNA甲基化修饰机制或许会成为治疗神经病理性疼痛的新的药物靶点。