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阿尔茨海默病（Alzheimers Disease，AD），又称老年性痴呆，是一种以进行性认知功能障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退变性疾病，伴有不同程度的运动、认知、语言和人格等多方面的异常。年龄是AD的基本危险因素。该病常见于老年人，其发病率随年龄增长而逐渐上升。AD的病因复杂，目前仍无有效的治疗方法，给家庭、社会带来沉重负担。因此，寻找有效的AD治疗措施至关重要。
神经元溃变是AD的一个重要病理变化，基底前脑是AD脑皮质下神经元丢失最严重的区域，该区胆碱能神经元丢失最严重，还同时伴有GABA能神经元、去甲肾上腺能神经元和五羟色胺能神经元的丢失。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）能够促进胆碱能神经元存活、生长、分化及保护受损的胆碱能神经元并减轻其退化，对γ-GABA能神经元、多巴胺能神经元也有营养作用。但以BDNF治疗AD，还面临诸多困难，主要是因为BDNF为多肽，分子量大，难透过血脑屏障，且BDNF的生物半衰期往往较短，局部使用很快被稀释和代谢，需反复大剂量应用。
缓释微球给药系统为解决这一问题带来新的希望。利用可生物降解材料制备缓释微球，可通过聚合物降解恒定释药一段时间，解决蛋白或多肽应用时生物半衰期短、稳定性差、易降解的问题，并减少给药次数和给药量，减轻药物的毒副作用，目前应用最广泛的聚合物是PLGA[poly（lactide-co-glycolide）]。PLGA是一种无毒、可生物降解的高分子聚合物，其最终降解产物是H2O和CO2，具有很好的生物相容性。以PLGA为包裹材料制备缓释微球，微球内的蛋白或多肽将随着PLGA的降解而逐步释放，达到缓慢释药的目的。
鉴于BDNF在促进神经元生存、修复、分化等各方面的重要功能和可生物降解缓释微球在长效缓释药物方面的作用，本研究就以PLGA为材料包载BDNF制备缓释微球进行实验，以期达到持续释放BDNF，避免多次用药，维持BDNF活性的目的。
本课题研究内容包括：1、以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白制备BSA-PLGA缓释微球，探索微球制备的优化条件。2、根据优化条件制备BDNF-PLGA缓释微球，并对微球进行评价。
第一部分 BSA-PLGA缓释微球的制备及优化条件的探索
一、材料和方法：
以复乳-溶剂挥发法制备BSA-PLGA微球。一定量BSA溶于100μl双蒸水得内水相（W1），适量PLGA溶于4ml二氯甲烷（DCM）得油相（O），将W1倒入O中，冰浴下超声40s，得W1/O初乳。适量聚乙烯醇（PVA）溶于25ml双蒸水得外水相（W2），将W1/O初乳缓慢倒入W2中，冰浴下以2，000rpm匀速搅拌6min，得W1/O/W2复乳，常压磁力搅拌3-4h挥发有机溶剂，15，000rpm离心5min，去离子水洗5次去掉微球表面的PVA和没有包进的药物，冷冻干燥48h，去除微球中的水分。以正交设计研究不同制备条件对微球粒径、载药量和包封率、释放量的影响。于内水相中加入不同种类和浓度的添加剂，考察其对微球粒径、载药量和包封率、释放量的影响。
二、结果：
BSA-PLGA微球的形态圆整，表面光滑。正交设计试验结果表明，BSA投药量的增大并不使微球的包封率增加，反而使微球的突释增大，粒径稍大。油相PLGA用量增大，制备的微球粒径略为增大，突释减少，包封率明显提高。提高外水相PVA浓度，使微球的包封率显著提高，突释量和粒径明显减小。增大乳化超声功率对微球的粒径和突释量几乎没有影响，却能明显提高包封率。在37℃、PH7.4的PBS体外释放体系中，BSA-PLGA微球能持续释放45天。以不同浓度的聚乙二醇6000（PEG6000）、吐温-20（Tween-20）和海藻糖（Trehalose）作为添加剂加入到内水相中制备微球，从实验结果分析，加入不同添加剂的各微球组与无添加剂的微球组比较，粒径增大明显（P<0.05），突释降低显著（P<0.05）[Trehalose：BSA=1：8组除外]，包封率和累计释放量均明显提高（P<0.05）。除PEG6000外，其余添加剂浓度的提高可显著增加微球的包封率、粒径和累计释放量，降低突释（P<0.05），其中以Trehalose：BSA=1：4组包封率（96.83%）和累计释放量（73.22%）最高，3% Tween-20组突释量（10.01%）最低。综上所述，优化制备条件，使BSA投药量为10mg、PLGA用量为250mg、PVA浓度为1.5%、超声乳化功率为60w，并在内水相中加入适当的添加剂，可得高包封率、低突释量、粒径约为20μm、持续释放BSA达45天的缓释微球。
第二部分 BDNF-PLGA缓释微球的制备及评价
一、材料和方法：
以复乳-溶剂挥发法制备BDNF-PLGA微球一定量的蛋白（BDNF：BSA=1：2，000，w/w）溶于100μL双蒸水得内水相（W1），250mg PLGA溶于4ml DCM得油相（O），将W1倒入O中，冰浴下超声40s，超声功率60W，得W1/O初乳。以1.5% PVA溶液25ml为外水相（W2），将W1/O初乳缓慢倒入W2中，冰浴下以2，000rpm匀速搅拌6min，得W1/O/W2复乳，常压磁力搅拌3-4h挥发有机溶剂，15，000rpm离心5min，去离子水洗5次去掉微球表面的PVA和没有包进的药物，冷冻干燥48h，去除微球中的水分。研究不同制备条件和添加剂对微球粒径、载药量和包封率、释放量的影响，并以PC12细胞检测从BDNF-PLGA微球释放的BDNF的生物活性。
二、结果：
BDNF-PLGA微球的形态圆整，表面光滑，粒径分布较均匀。体外释放过程中，微球在PBS溶液中呈现逐渐降解的趋势。释放一周后微球表面孔隙增多，但仍保持圆形；三周后微球呈现多孔的表面，形状开始不规则，提示微球内部基质已经开始降解；六周后，多数的微球已经失去圆形的外表，出现塌陷，呈碎片状。随着内水相中蛋白浓度的提高，微球的载药量和粒径显著增大（P<0.05），但包封率却明显下降（P<0.05）。蛋白/PLGA比率为10/250时，包封率88.21%，20/250时，包封率只有62.79%。当蛋白/PLGA比率由10/250升至20/250，突释由18.03%升到30.60%，累计释放量由60.54%升到78.51%。随着内水相中PEG6000、Tween-20和Trehalose浓度的增加，微球中BDNF的包封率随之增加，其中以Trehalose：BSA=1：4组增加最为显著，包封率达96.12%。微球中BDNF的突释量随着添加剂浓度的增加而降低，其中以3% Tween-20组的突释量最低，只有10.81%。微球的粒径随着添加剂用量的增加而增大，其中以Trehalose：BSA=1：4组微球粒径增加最明显。在37℃、PH7.4的PBS体外释放体系中，BDNF-PLGA微球能持续释放BDNF45天，不加添加剂微球组45天累计释放量为60.54%，加入不同浓度和种类添加剂后，45天的累计释放量皆有所提高，以Trehalose：BSA=1：4组累计释放量最多，有73.20%。以PC12细胞行体外的BDNF活性检测，从BDNF-PLGA微球中释放的BDNF能使PC12细胞呈多角形，并长出突起，分化为神经元样细胞，表明从微球中释放的BDNF具有良好的生物活性。综上所述，当蛋白/PLGA比率为10/250、内水相中加入适当的添加剂时，可制得高包封率、低突释量、粒径约为20μm、持续释放BDNF达45天的缓释微球。
结论：
1.成功制备BSA-PLGA缓释微球，并通过优化制备条件得到高包封率、低突释量、粒径约为20μm、体外持续释放BSA达45天的微球。
2.根据BSA-PLGA缓释微球的制备条件，成功制备BDNF-PLGA缓释微球。
3.当蛋白/PLGA比率越高，BDNF-PLGA缓释微球载药量越高，但包封率则越低，突释明显增加。
4.当内水相中加入适当的添加剂，可使BDNF-PLGA缓释微球包封率和体外释放量提高、突释减少。
5.BDNF-PLGA缓释微球持续释放BDNF达45天，且释放的BDNF具有良好的生物活性。