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本文对Gal诱导文库中的OsMT1基因的表达情况进行分析,克隆得到OsMT1基因的全长,并构建了OsMT1基因的超表达载体和启动子表达载体。通过农杆菌介导的方法,转化水稻愈伤组织和烟草无菌苗,初步得到转基因的生根的幼苗,为进一步研究OsMT1基因和启动子的功能奠定基础。通过外施ABA诱导基因的表达,对基因进行初步分离和筛选,得到诱导的相关基因,同时对基因进行RT-PCR鉴定。本文的主要研究结果:
(1)OsMT1基因的表达分析
经过Gal和铝毒的处理,然后分别提取湘糯1号叶和根的RNA。通过Northern杂交分析发现OsMT1基因主要在根中表达,在叶中的表达不明显。在铝处理下前期OsMT1的表达受到抑制,然而5天后它的表达受到诱导。在不同发育时期出现变化,处理前期幼苗期根中OsMT1表达量低,后期恢复到正常水平。
(2)OsMT1基因生物信息学分析,构建超表达载体,农杆菌介导法转化水稻
设计特异引物,通过RT-PCR技术从Gal诱导的cDNA文库中克隆得到OsMT1基因。克隆得到的OsMT1基因长270bp,开放阅读框231bp,编码76个氨基酸,其中半胱氨酸含量为14.5%,MT1蛋白的保守核心结构域在17-76氨基酸之间。利用在线软件预测MT1蛋白的理化性质得出,相对分子质量为7.55KD,等电点为4.79。用ClustalX l.8软件对OsMT1与其它几种常见植物的MT1氨基酸序列进行同源分析,与水稻OsMT-I-4a同源性达72%,而与小麦同源性为50%,发现同一类型的MT的同源性高,不同类型的MT同源性较低。通过亚细胞定位分析,预测OsMT1可能是一种定位于叶绿体和线粒体上的蛋白。构建了过量表达载体pOX-OsMT1,通过农杆菌介导转化水稻的愈伤组织,通过筛选得到生根的转化水稻幼苗。
(3)预测OsMT1启动子功能,构建植物转化表达载体,农杆菌介导法转化烟草
通过网站预测,得到大部分与光反应有关的元件、部分逆境相关元件和内外源激素相关元件。设计特异引物,通过PCR从水稻基因组DNA中克隆得到启动子,克隆得到的OsMT1启动子长度为1380bp,构建了植物表达载体pCAMBIA1300-PRO。农杆菌介导转化烟草无菌苗,得到生根筛选的烟草幼苗。
(4)ABA诱导差异基因的表达分析
把DDRT-PCR基础上分离出来的多个差异片段,连接T载体,进行测序并得到序列。把得到的30多个差异片段进行生物信息学分析,然后设计部分序列的引物,进行RT-PCR验证。各差异基因在15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h不同时间点表达情况分析。通过4个差异片段的验证,得到一个诱导的差异片段,而其它3个片段的表达没有变化。