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糖苷类化合物(Glycoside compounds)是一类广泛分布于自然界中的功能性分子,其在细胞识别、生长调控、信号传递、结构支持等多个方面起着重要的作用。由糖苷类化合物衍生而来的糖缀合物(Glycoconjugates),由于其高表面活性、抗菌性、高水溶性、高生物相容性等独特的理化性质,近年来受到了广泛的研究与关注。糖苷水解酶(Glycoside hydrolases,EC 3.2.1)是一类特异性水解糖苷键的水解酶类,其既可水解糖苷类化合物中糖基之间的糖苷键,又可以水解糖缀合物中糖基与非糖基之间的糖苷键。根据人们对其水解机理的研究发现,绝大多数糖苷水解酶通过控制底物与水的比例可以行使转糖苷活力。较之糖基转移酶而言,使用糖苷水解酶从糖苷类化合物出发合成新型的糖缀合物,成本更为低廉,更具有产业化价值。这其中,源自嗜热微生物的嗜热糖苷酶,由于其具有很高的热稳定性、有机溶剂耐受性,并且在高温下具有较高的反应活性,符合工业生产上的需求,与耐受性差、易失活的常温糖苷酶相比,更具有产业化优势。特别是在合成糖缀合物的过程中,高反应温度能够大大提升反应速率,降低体系粘度,避免微生物污染,因此使用嗜热糖苷酶合成糖缀合物有着十分显著的优势。分离自日本热泉中的嗜热厌氧菌Dictyoglomus thermophilum H-6-12能够在70℃的条件下利用木质纤维正常生长。其基因组中包含大量的糖苷水解酶基因,其中,基因序列ACI18764.1被认为编码GH3家族的β-葡萄糖苷酶。本课题通过Blast分析,确认该基因为GH3家族的β-葡萄糖苷酶,并通过PCR成功获得了该基因的体外扩增。通过分子生物学方法,我们将该基因转入大肠杆菌表达载体p ET-28a中,成功构建了表达工程菌,实现了该β-葡萄糖苷酶的异源可溶表达。利用p ET-28a提供的组氨酸标签,我们使用Ni-NTA层析柱通过金属离子亲和层析,获得了较纯的的蛋白。对重组β-葡萄糖苷酶Dt0262酶学性质的表征表明,该酶对人工合成底物p NPGlc与天然底物纤维二糖均具有水解效果。对p NPGlc的最适水解条件为80℃,p H 6.0;对纤维二糖的最适水解条件为75℃,p H 5.5。动力学常数测定结果表明,重组β-葡萄糖苷酶Dt0262对p NPGlc的Km与kcat分别为0.23m M与0.64s-1,对纤维二糖的Km与kcat分别为3.57m M与0.88s-1,根据kcat/Km的大小可知,该酶更偏好于水解p NPGlc。对该酶的稳定性研究表明,重组β-葡萄糖苷酶Dt0262在70℃下相对稳定,t1/2可达到92h,而在80℃与90℃下,其t1/2分别缩短至20.3h与21.8min。此外,该酶还表现出明显的热激活效果,在70℃与80℃下孵育0.5h后,酶活分别变为原来的1.32倍与1.46倍。p H稳定性研究表明,该酶能够在较为宽泛的p H条件下保持稳定。金属离子依赖性研究显示,重组β-葡萄糖苷酶Dt0262为非金属离子依赖性酶。通过对该酶的表征我们发现,Dt0262确为嗜热β-葡萄糖苷酶,具有应用于糖缀合物合成方面的潜力。