论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是以母猪流产及仔猪呼吸系统障碍为主要病征的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。该病毒传染性强,而且感染机体后致免疫抑制及各种并发症,给养猪业造成巨大危害和经济损失。病毒基因的变异也给防治增加了难度。糖基化囊膜蛋白5(GP5)是PRRSV的主要结构蛋白,具有结合细胞受体及诱导细胞凋亡等功能,而且该蛋白能诱导中和抗体产生,是新型疫苗设计的主要靶蛋白,因此在病毒的生理功能及PRRS的防治上具有重要作用。PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合。利用细胞内吞作用而感染易感细胞,如猴肾细胞(MA-104, Marc-145)和PAM。至今已报道了四个独立但功能相关的PRRSV细胞受体:唾液酸粘附素(Sialoadhesin)受体、似肝磷脂蛋白(Heparinlike)受体、波形蛋白(Vimentin)受体、清道夫受体(CD163)蛋白。本研究利用本试验室分离保存的一株PRRSV北美洲型野毒株SD-TA,通过DNAStar软件分析其GP5蛋白的抗原表位可能性及参考大量文献,将ORF5基因分为4段(79-207,133-330,229-492及382-603)进行原核表达。成功构建了pGEX-6p-1原核表达载体,转化入E. coli .BL21(Rosetta)感受态细胞中进行诱导表达。表达得到四段重组蛋白GP5-1,GP5-2,GP5-3及GP5-4,经SDS-PAGE分析,其分子量大小分别为30.9kD,33.3kD,35.9kD及34.5kD。将纯化的4段重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠,小鼠三免后血清经I-ELISA检测,特异性抗体滴度达到1:100000,表明4段重组蛋白具有很强的免疫原性。运用IFA方法研究GP5全长蛋白及分段蛋白与PRRSV易感细胞Marc-145细胞的相互作用表明,GP5全长蛋白、GP5-1蛋白及GP5-2蛋白均能与Marc-145细胞膜结合,GP5-3蛋白及GP5-4蛋白不能与Marc-145细胞膜结合。运用I-ELISA方法检测GP5全长蛋白及分段蛋白与PRRSV宿主细胞受体蛋白之间的相互作用表明,GP5-1能够与唾液酸粘附素和CD163的部分片段结合,GP5-4能够与唾液酸粘附素的部分片段结合。