论文部分内容阅读
洛克沙胂是国内外广泛使用的一种有机胂饲料添加剂,近来的研究表明其能促进人血管内皮细胞生长,存在着促血管生成作用及潜在的致癌风险。有关洛克沙胂促血管内皮细胞生成作用的研究极少,国内未见报道。本研究进行了大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定,并利用MTT法检测细胞活力、流式细胞术检测细胞周期、划痕实验检测细胞的迁移能力,初步探讨洛克沙胂对血管内皮细胞生长的影响。采用大鼠主动脉植块法和I型胶原蛋白酶酶消化法分离大鼠主动脉内皮细胞；采用差速消化法去除内皮细胞中的杂细胞,通过DMEM培养基中加入VEGF和肝素钠进行条件培养,并进行了传代培养和生长曲线的绘制；通过外观形态、电镜分析以及免疫组化方法对分离培养的细胞进行了鉴定。分离培养的细胞呈多角形、“铺路石”状；透射电镜下观察可见分离培养的细胞具有内皮细胞特征的W-P小体；CD31SABC免疫组化及免疫荧光分析均呈阳性。内皮细胞经不同处理培养6h后用MTT法检测细胞活力。各组洛克沙胂的浓度分别为10.00μM.1.00μM、0.10μM、0.0μM,5ng/mL VEGF为阳性对照,PBS为阴性对照。试验结果显示洛克沙胂及VEGF阳性对照组OD值与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)；洛克沙胂在0.01μM～1.00μM范围内,随着剂量增加OD值随之增加,呈现一定的剂量效应关系。1.00μM洛克沙胂组与5ng/mL VEGF组的OD值相当；但10.00μM洛克沙胂组与1.00μM洛克沙胂组的OD值相比没有增加反而减少,与0.01μM洛克沙胂组相当。证明洛克沙胂较低剂量对血管内皮细胞生长有明显的促进作用,而较高剂量(10.00μM)促血管内皮细胞生长的作用减弱。内皮细胞经不同处理,培养6h后用流式细胞术检测细胞周期。洛克沙胂浓度分别为10.00μM、1.0μM、0.10μM,5ng/mL VEGF为阳性对照,PBS为阴性对照。0.1μM、1.0μM洛克沙胂组以及VEGF对照组S期细胞数量明显高于PBS对照组；G2期细胞数量低于PBS对照组；而G1期无显著性差异。结果表明0.1μM、1.0μM洛克沙胂具有明显的促内皮细胞增殖的作用。划痕实验中洛克沙胂浓度分别为10.00μM、1.00μM、0.10μM,5ng/mL VEGF为阳性对照,PBS为阴性对照。划痕后,内皮细胞经洛克沙胂处理12μM后镜下拍照。结果表明洛克沙胂0.01μM～1.00μM范围内,随剂量增加促进内皮细胞迁移作用加强,1.00μM时促迁移能力最强,10.00μM时促进作用反而减弱。综上所述,本研究已建立了从大鼠主动脉分离培养内皮细胞的方法。0.01μM-10.00μM洛克沙胂对内皮细胞的增殖和迁移具有明显的促进作用；且在0.01μM-1.0μM范围内,随剂量增加而增加,10.00μM时作用反减弱。