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蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting with Cα kinase，PICK1)是PKCα和膜上相应靶受体间的衔接蛋白，普遍存在于人与动物的各种细胞和组织内，其中小鼠来源的PICK1由416氨基酸残基组成，主要由N端的PDZ结构域和C端的BAR结构域组成，另外靠近两个末端各含有一个短的酸性氨基酸区。α-SNAP蛋白在膜泡转运过程中，主要对开启NSF蛋白的ATP酶活性起到分子开关的作用。作为PICK1相互作用蛋白之一，α-SNAP可通过与PICK1蛋白形成复合体来协助PICK1调节突触后膜AMPA受体数量，进而调节神经信号的传导。本文分别对PICK1蛋白、α-SNAP蛋白进行了基因克隆、蛋白的重组表达和纯化，通过体外pull-down和体内酵母双杂交等实验验证了两者的相互作用，并通过基因的定点突变和截短突变对它们之间的结合部位进行了进一步的研究。 以实验室保存的重组质粒pRK5-pick1为模板，根据表达载体pGEX-6P-1和pMAL的酶切位点和数据库中已知PICK1基因序列，设计特异性引物经PCR扩增获得PICK1基因，分别克隆上述两个载体并转化E.coli BL21中进行表达。SDS-PAGE分析两种载体内均为可溶性表达，其目的蛋白占细胞总蛋白的25％以上，经亲和层析和Sephacryl S-200凝胶层析两步纯化获得了电泳纯的PICK1融合蛋白。分别设计PDZ结构域和BAR结构域的引物按上述同样方法分别构建了pMAL-S-bar，pGEX-6P-1-pdz，pET-32N-pdz重组质粒，并通过相应的亲和层析和凝胶层析得到电泳纯的目的蛋白。所有目的蛋白均经Western blot实验进行了验证。 根据α-SNAP的基因序列设计引物以pQE9-α-snap为模板将α-SNAP蛋白基因克隆到表达载体pET-32N和pGEX-6P-1中，并在E.coli BL21中进行表达，SDS-PAGE分析表明可溶性的融合目的蛋白表达量均可达到菌体总表达蛋白的35％左右，进一步经相应的亲和层析和凝胶层析得以较高纯度的分离纯化。进一步根据α-SNAP蛋白的分子结构设计相应引物分别构建各截短突变SNAP1-115、SNAP1-160、SNAP116-295的pET-32N重组质粒，后经Ni2+-NTA agrose亲和层析和Sephacryl S-200凝胶层析获得电泳纯的SNAP不同片段的突变体。 通过pull-down实验比较α-SNAP和PICK1蛋白及其两个结构域相互作用情况，初步证实α-SNAP蛋白与PICK1有较强的相互作用，且推测其作用位点在PDZ结构域，进一步实验证实与PDZ结构域相互作用的SNAP区段位于1-115氨基酸残基片段(SNAP1-115)，在此基础上，分别构建了相同片段的酵母双杂交系统的重组质粒，在细胞体内分析了α-SNAP蛋白与PICK1蛋白间的识别位点，与前述结果一致酵母双杂交实验也同样证实了两者的相互作用位点分别为PDZ结构域和α-SNAP蛋白的1-115位肽段区域。