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研究背景:8羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2deoxyguanosine,8-OHdG)是活性氧自由基如羟自由基、单线态氧等攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物,若不被及时清除可引起DNA复制过程中G-C/A-T型碱基配对错误从而引起基因点突变甚至癌变。研究表明糖尿病、癌症、以及心血管疾病的发病和疾病发展都与氧化损伤有着密切的关系,也都可以检测到机体8-OHdG含量的升高,因此测定机体8-OHdG水平不仅可以评估机体受到的氧化损伤程度,还可以辅助相关疾病的诊断或反映相关疾病的进程。研究目的:本次实验旨在研究获得8-OHdG特异性配对抗体,建立生物素-亲和素双抗夹心ELISA检测8-OHdG的方法,并在此基础上检测妊糖患者和健康孕妇的8-OHdG含量,对比研究妊娠糖尿病与8-OHdG水平的关系。研究方法:本研究通过偶联形成8-OHdG-mcKLH复合物作为免疫原,免疫注射Balb/C小鼠,并进行细胞融合得到单克隆抗体。通过ELISA法筛选获得阳性杂交瘤细胞株,再对细胞株进行扩大化生产,并对得到的腹水抗体进行纯化,筛选得到8-OHdG的高特异性配对抗体。通过测定抗体纯度、交叉反应性、效价等方法判断该单克隆抗体的特异性和灵敏性。以配对抗体为基础,通过筛选包被液、封闭液、包被抗体与酶标抗体的浓度等条件,建立生物素-亲和素标记的双抗夹心ELISA定量检测8-OHdG的方法,并通过批内批间实验、回收率等方法来评价该检测方法的稳定性及准确性。在此基础上初步探究了 8-OHdG与妊娠糖尿病的关系。研究结果:1.本研究得到了一对针对8-OHdG特异性的配对抗体;2.本研究利用该配对抗体建立了生物素-亲和素标记的双抗夹心ELISA定量检测8-OHdG的方法;3.本研究将该方法用于检测妊娠糖尿病患者的样本,并通过患者和与健康孕妇的比对,发现妊娠糖尿病患者机体8-OHdG水平高于对照组,提示8-OHdG的升高与妊娠糖尿病发生具有一定的相关性。结论:1、本研究以获得8-OHdG特异性配对抗体为基础,建立了生物素-亲和素双抗夹心ELISA检测方法。并在此基础上进行检测条件的优化,从而建立起具有良好特异性的8-OHdG检测方法。利用该方法对部分妊娠糖尿病患者及健康孕妇的样本进行检测,发现妊娠糖尿病患者的8-OHdG水平高于对照组,提示8-OHdG在孕妇体内水平的异常改变可能与妊娠糖尿病的发生以及疾病的进程具有密切的联系。2、本研究获得的特异性配对抗体不仅可用于上述ELISA试剂盒的研制,还可用于氧化损伤方向的联合免疫诊断试剂的开发。本研究建立的生物素-亲和素双抗夹心ELISA检测方法弥补了目前8-OHdG检测的空白,为研究氧化损伤与疾病关系提供了更为准确、便捷的检测方法。