蛋白-DNA和蛋白-沉淀剂体系的超快溶剂化动力学研究

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水合化层的水是蛋白质结构、稳定性、动力学和功能等的基础,研究蛋白质的溶剂化(水合化)动力学对于分析和理解蛋白质的诸如折叠、聚合、识别底物和与底物相互作用等行为是十分重要的。本文着重叙述了对蛋白-DNA底物界面和蛋白-沉淀剂混合体系的超快溶剂化动力学的系统研究。通过超快荧光光谱学的探测方法,我们利用蛋白中内在固有的荧光氨基酸--色氨酸作为光学探针来探测其周围的局域溶剂环境。   在对DNA聚合酶β的研究中,通过定向位点突变的基因技术,色氨酸探针被依次放置于酶结构中DNA绑定区域的12个选定位置上,从而得以探测蛋白-DNA界面处水的快速运动。溶剂化动力学相关函数可以表示为两指数衰减的模型,代表快慢不同的两个溶剂化弛豫过程:第一个快溶剂化过程代表光扰动后最初的局域水分子的弛豫运动,而第二个慢溶剂化过程代表之后的水合化层水分子网络的重新排布,同时耦合了蛋白质局域结构的波动。解析得到的溶剂化动力学反映了DNA底物绑定区域水的快速运动能力,这有助于酶对底物的输运和识别。在酶与DNA底物的混合体系中,溶剂化动力学相对缓慢,说明界面处的水分子网络和蛋白局域结构更加刚性。然而,在酶活性位点和核苷酸底物的入口位置,水的运动相对于DNA绑定区域内部更快,这对于核苷酸底物的输运是有利的。   在对蛋白-沉淀剂混合体系的研究中,枯草杆菌蛋白酶因其结构中只含有一个色氨酸残基且位于蛋白表面而被用作目标蛋白。在蛋白与聚乙二醇类沉淀剂的混合体系中,溶剂化动力学显著变慢,反映了沉淀剂的引入对蛋白表面水分子网络弛豫运动的强烈限制以及造成蛋白局域结构刚性变强。深入分析表明,对于结晶效果不同的沉淀剂,随着其浓度的增加,第二个慢溶剂化动力学过程的特征参数呈现不同的变化趋势。这种结果揭示了特定沉淀剂对于水分子网络和蛋白局域结构的特殊稳定作用:对于能够使蛋白结晶的沉淀剂,第二个溶剂化特征时间常数几乎不随沉淀剂浓度变化,说明在沉淀剂浓度很低时蛋白表面水合化层的水就已经被完全稳定,这对于蛋白分子有序地聚集从而形成结晶是有利的。   研究溶剂化动力学需要用到超快荧光光谱学技术。本文也介绍了实验室中的几种时间分辨荧光光谱的探测方法,以及分析和构建溶剂化相关函数的详细步骤。作者负责建设的生物物理实验室的功能和现状被简要说明。文中同时叙述了生物学上从定向位点突变设计、基因转化表达到蛋白质纯化的整套获得目标蛋白的方法,以及几种不同蛋白的详细纯化步骤。生物学方面的实验是本文相关工作和作者博士期间研究的重要组成部分。
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