1、抗酒石酸酸性磷酸酶的纯化及性质研究;2、酵母蔗糖酶提取方法的比较及性质鉴定

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人类抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是位于第19号染色体p13.2~13.3处的一个基因编码的单一同工酶,该酶是一种结构高度保守的含铁糖蛋白,分子量为30~40kD之间。不同人种来源的30~40kD TRAP氨基酸序列的同源性为85%~95%,其差异性起源于转录初期的选择性剪切和使用不同的翻译起始部位,或翻译后蛋白质的修饰,而不是产生于多基因家族。 TRAP具有与其它酸性磷酸酶不同的特性,不受酒石酸盐抑制。最适pH为4.9~6.5,等电点pI在8.5~9.5之间。大多数TRAP可以被巯基化合物、抗坏血酸和酒石酸盐等化合物激活。TRAP主要存在于人巨噬细胞、破骨细胞、Gaucher细胞、人的肺、骨和胎盘组织中。 猪Uteroferrin(UF)是一种含铁糖蛋白,分子量为35kD,等电点为9.7,具有刺激早期胚胎造血细胞增殖与成熟的作用。Uteroferrin的cDNA与人类TRAP的cDNA同源性大于85%,并且UF与TRAP由同一个基因编码,与人类TRAP有着十分密切的关系。 通过综合SP—Sepharose阳离子交换柱层析、MonoS阳离子交换柱层析、、Q—Sepharose阴离子交换柱层析、SuperdexTM75凝胶过滤层析和ConA—Sepharose亲和层析等多种层析方法从人的胎盘组织中纯化TRAP,并对其性质进行了研究。经比较通过SP—Sepharose阳离子交换柱层析纯化的TRAP的比活力是Q—Sepharose阴离子交换柱层析获得TRAP的2倍,并且阳离子交换柱层析可以更好的去除杂蛋白,有利于TRAP进一步纯化。通过研究发现,先经SP—Sepharose阳离子交换柱层析、再经MonoS阳离子交换柱层析、最后经SuperdexTM75凝胶过滤层析是从人类胎盘组织中纯化TRAP的最优方法之一,纯化后TRAP的比活力为58.73U/mg,纯化倍数提高至60倍。 在以pNPP为底物测定TRAP活性时加入β-巯基乙醇、钼酸钠、酒石酸钾钠等化合物,结果显示磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、钼酸钠、氟化钠、过氧化氢对TRAP酶活性有抑制作用;β-巯基乙醇和氯化镁对酶活性有促进作用。将纯化的TRAP进行酸性非变性不连续PAGE电泳,随后将分离胶浸入含FastGarnet GBC和α-萘酚磷酸盐的0.2mol/L,pH4.9 NaAc—HAc缓冲液中进行TRAP活性染色,出现了深棕红色沉淀,对TRAP的纯度进行了验证。经SDS—PAGE鉴定其相对分子质量为28kD,等电聚焦测定等电点为9.0。通过MTT法测定细胞活性,GM—CSF依赖性TF-1细胞株在加入纯化的TRAP但没加GM—CSF情况下仍生长旺盛,说明TRAP表现出GM—CSF促进造血细胞增殖的功能和类似造血生长因子的作用,有一定的药物开发价值。
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