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病毒蛋白R(ViralProteinR,Vpr)是HIV编码的四个辅助蛋白之一,也是HIV非结构蛋白中唯一一个被包装入病毒粒子的蛋白分子,在HIV的致病机理中发挥重要作用,是一个多重功能蛋白。Vpr可促进HIV-1LTR的转录;促进整合前复合体的入核运输;诱导G2期阻滞和促进细胞凋亡等。由于Vpr在HIV-1的生命周期中发挥重要作用,使其成为抗HIV治疗的新靶点。
本课题选择HIV-1vpr,基因作为靶点,采用RNAi技术干扰其表达。实验中构建了两个Vpr与荧光蛋白的融合表达载体pEGFP-Vpr和pVpr-DsRed,以及13个针对vpr基因不同位点的shRNA表达载体和4个miRNA表达载体。采用荧光显微镜技术和流式检测技术初步筛选到shRNA4和miR2对GFP-Vpr或Vpr-DsRed融合蛋白的表达有明显的抑制作用,shRNA14、shRNA7、和shRNA5次之,而shRNA11、shRNA9、shRNA13、shRNA10、miR4、miR3无明显的抑制作用。在RNA水平采用Real-timePCR技术对vprmRNA进行相对定量结果显示,shRNA4和miR2处理组的2-△△Ct值仅为0.0094和0.2088,对vprmRNA有明显的降解作用。对shRNA进行量效反应关系研究时发现随着shRNA4剂量的增加,其对靶基因的抑制作用亦增强。在病毒水平上采用假病毒体系的研究发现shRNA4和miR2可以影响假病毒的包装和复制能力。此外,在相同的实验条件下针对vpr基因中同一靶序列时,与采用Ⅲ型启动子表达shRNA的干扰效果相比,采用Ⅱ型启动子表达miRNA对靶基因的抑制作用较强。