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背景与目的癫痫(epilepsy,EP)是由多种原因导致的脑部神经元高度同步化异常放电所致的临床综合征,其反复发作给广大患者带来了极大痛苦。随着现代医学的发展,我们对癫痫的认识越来越深入,各种新型抗癫痫药物相继问世,为广大患者带来了希望,但是截至目前为止仍然有超过200万的患者属于难治性癫痫范畴。以往的研究与治疗主要针对抑制异常的神经电活动及控制癫痫发作本身,而癫痫发病机制的不确定性才是其难治的根本原因。凋亡是细胞程序化的死亡,是细胞为更好的适应环境而采取的一种主动死亡方式,对维持生理机能至关重要。近些年,神经元凋亡在癫痫发作过程中的作用越来越受到人们关注。所以研究神经元的凋亡机制,并在分子水平甚至基因水平干预调节凋亡的发生,最大限度的保护及恢复异常放电神经元的功能对于解决难治性癫痫这一难题来说显得尤为重要。线粒体作为绝大多数真核生物细胞中的由两层膜包被的细胞器,其功能已得到广泛研究。研究证实线粒体不但可以通过氧化磷酸化为组织提供能量,并且在稳定细胞内钙离子浓度、调节氧化应激水平、调控凋亡等方面均发挥着不可替代的作用。随着研究的不断深入,其在癫痫发病中的作用日益受到人们重视,线粒体功能障碍可能会导致癫痫发作过程中神经元凋亡的增加,并且对痫性损伤更加敏感。一些定位于线粒体内的蛋白质在神经元异常放电过程中会从线粒体内释放出来,然后对下游一些凋亡相关因子产生影响从而促进凋亡或坏死的发生。所以痫性发作过程中发生移位的一些蛋白质,有可能为临床上癫痫的治疗提供新思路。Omi/HtrA2是一种位于线粒体膜间隙的促凋亡的丝氨酸蛋白酶,其最初被认为是存在于大肠杆菌内的一种热休克蛋白,能够降解错误折叠的蛋白质。随着研究的不断深入,逐渐发现其促凋亡功能。据报道它主要通过两种途径促进细胞发生凋亡,即caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖性途径和caspase非依赖性途径。caspase依赖性途径即Omi/HtrA2移位到胞浆后,通过与IAPs(凋亡抑制因子)结合,主要是XIAP(X连锁凋亡抑制因子),使IAPs-caspase复合体解离或对IAPs进行降解,从而激活caspase,发挥其促凋亡作用。非caspase依赖性途径则单独依靠其蛋白酶活性发挥促凋亡作用。目前,大量国内外研究表明Omi/HtrA2在多种动物模型中,例如脑缺血/再灌注损伤、肾脏缺血再灌注损伤等,均发挥不可替代的促凋亡作用,且据国外文献报道其在匹鲁卡品致痫的癫痫动物模型中也发挥促凋亡作用。但目前尚缺乏体外癫痫模型中其对神经元的影响的相关研究。此次研究通过Sombati法(无镁细胞外液致痫)建立海马神经元自发性痫性放电的体外模型,通过免疫蛋白印迹等多种方法观察Omi/HtrA2在体外癫痫模型神经元凋亡中的作用机制,并使用其特异性抑制剂Ucf-101,观察其对神经元凋亡、XIAP、HAX-1(HS-1-associated protein X-1)等下游蛋白表达的影响,探讨Ucf-101的神经元保护作用,为临床上治疗癫痫提供理论依据。材料与方法取新生24小时内的Sprague-Dawley大鼠乳鼠,75%酒精浸泡消毒,剪刀断头并剥离双侧大脑半球,置于培养皿中(事先加入预冷的磷酸盐缓冲液),剥离双侧海马,并将其表面的毛细血管剔除,并最终制成单细胞悬液,调整细胞为合适密度并接种于培养板中,体外进行新生24小时内大鼠海马神经元的原代培养。培养过程中注意观察神经元的生长状态,直至第7-10天终止培养用于后续操作。选取生长至第7天的海马神经元,采用免疫荧光的方法进行神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)神经元纯度鉴定。海马神经元培养至第10天,随机进行分组。神经元用配制好的正常细胞外液作用3h后,再用正常维持液继续培养,此即对照组。并按照Sombati法制造模型组,即先用无镁细胞外液培养3h,再换细胞维持液继续培养,并分别于3h、8h、24h后终止细胞培养,此即致痫后3h组、8h组、24h组。再随机将神经元分为对照组、致痫24h组、Ucf-101处理组和DMSO(二甲基亚砜)组。其中Ucf-101组事先加入10μmol/L Ucf-101作用24h,再行无镁细胞外液诱导,致痫后继续培养24h。DMSO组事先给予相同浓度的DMSO作用24h,再行无镁外液诱导,致痫后继续培养24h,终止培养。采用TUNEL法检测各组神经元凋亡情况,免疫蛋白印迹法(Western blot)观察神经元Omi/HtrA2、XIAP、caspase3、HAX-1蛋白的表达变化。结果1.倒置相差显微镜下观察细胞形态:刚接种于培养板中的海马神经元形态呈圆形,体积较小。培养3h后开始贴壁,大部分神经元于24h后贴壁完成,少部分贴壁失败的细胞死亡。神经元培养一段时间后,开始长出粗细不等的突起,并逐渐增多、变长,5d后神经元之间通过不断增长的突起相互连接形成稀疏的网络。随着培养时间的延长,至第7d时,神经元立体感较强,连接也更为紧密,胞体大多呈椭圆形或三角形,细胞形态丰满,神经元网络较密集。2W后神经元胞体最大,此时轴突、树突清晰,细胞间网络更为密集。神经元生长至第4W时,可观察到大量脱落的细胞碎片悬浮于培养液中,细胞逐渐凋亡。2.神经元特异性烯醇化酶鉴定海马神经元纯度:海马神经元培养至第7天,采用免疫荧光细胞化学方法经神经元特异性烯醇化酶NSE染色鉴定,纯度为90%以上。3.Western blot结果:与CON组相比,Omi/HtrA2在线粒体中表达量在无镁诱导后3h有所升高,差异有统计学意义(P<0.05),但随着造模后时间的延长,Omi/HtrA2在胞浆中的表达量迅速升高,发生了从线粒体到胞浆的移动,这种移动尤其在致痫后8h、24h较为明显,与CON组比较有统计学差异(P<0.05)。与CON组相比,caspase-3蛋白表达量在无镁诱导后24h表达显著增多,差异有统计学意义(P<0.05)。与CON组相比,HAX-1蛋白表达量在无镁诱导后24h表达下降,差异有统计学意义(P<0.05)。但是XIAP蛋白的表达量CON组与无镁诱导后24h组相比无统计学差异(P>0.05)。与致痫后24h组相比,caspase-3的表达量在Ucf-101处理组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),而XIAP及HAX-1蛋白表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。DMSO组中caspase-3、XIAP、HAX-1蛋白表达量与致痫后24h组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。4.TUNEL法检测神经元凋亡结果:与CON组相比,致痫后24h组中凋亡的大鼠海马神经元数目明显增多,差异有统计学意义(P<0.05);Ucf-101组凋亡神经元数目较致痫后24h组显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);DMSO组中凋亡神经元数目与致痫后24h组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.大鼠海马神经元线粒体中Omi/HtrA2的含量在致痫后短时间内有所升高,随后发生了从线粒体到胞浆的移位。2.Omi/HtrA2移位至胞浆后通过降解XIAP发挥其caspase依赖性促凋亡作用,并能单独依靠其蛋白酶活性发挥caspase非依赖性促凋亡作用。3.使用特异性抑制剂Ucf-101可以使XIAP、HAX-1蛋白的降解明显下降,并能抑制caspase的激活及神经元的凋亡,对致痫后海马神经元有一定保护作用。