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尼古丁是烟草中含量最丰富的天然生物碱，是香烟中使人成瘾的主要化学物质。尼古丁本身具有高毒性，与生物接触后可以迅速的透过生物膜进入生物体内，因此是一种危害巨大的有机环境污染物。中国是最大的香烟生产国和烟草种植国，在香烟的生产过程中会产生大量的尼古丁，尼古丁的水溶性使其易于在环境中扩散，因此消除环境中的尼古丁污染十分必要。微生物是消除尼古丁污染的最佳选手，目前已经报道多株尼古丁降解微生物，这些微生物主要是通过吡啶途径（Pyridine pathway），吡咯烷途径（Pyrrolidine pathway），吡啶-吡咯烷混合途径（VPP pathway）和脱甲基途径（Demethylation pathway）等进行尼古丁代谢。在本研究开展之前，吡咯烷代谢途径和VPP代谢途径的分子机理研究还存在很大空白。 （一）对尼古丁降解吡咯烷途径降解的基因簇进行了分析并对关键酶 HspB的催化机理进行了研究。为了揭示恶臭假单胞菌 S16吡咯烷代谢途径的分子机理。本研究研究利用Illumina的paired-end测序技术对恶臭假单胞菌S16进行了全基因组测序、拼接和注释。恶臭假单胞菌S16具有一个大小为6.0 M的环状染色体DNA，没有质粒。通过进一步的生物信息学分析在该基因的上游和下游发现了尼古丁吡咯烷代谢途径相关的10个功能基因和2个调控基因，并发现这些基因位于基因组岛上，这为后续研究奠定了基础。 从野生蛋白HSP羟化酶（HspB）的纯化工作开始展开，本研究证明了HspB是吡咯烷代谢途径中关键酶，该酶可以催化6-羟基3-琥珀酰吡啶转化为2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）和琥珀酸。纯化出的HspB呈现黄色，在375 nm和460 nm处有特征吸收峰，是一个黄素单加氧酶，以FAD作为辅基，氧化反应依赖NADH，催化过程需要氧气的参与。分别利用18O标记的氧气和H2O作为底物进行反应，证明了氧气中的一个氧原子进入了底物2,5-DHP中，H2O中的氧原子进入了底物琥珀酸中。同时本研究将hspB基因连接到了载体pET28a中，并在大肠杆菌中进行异源表达，获得了大量高纯度的重组蛋白。利用快速停留装置研究了HspB的快速反应动力学。结果显示在还原半反应中，HSP先于NADH与酶结合，HSP的存在可以加速 NADH还原酶复合体的速率。在氧化半反应中，当HSP存在时在反应最初的20 ms中400 nm处可以观察到吸收值的明显上升，这说明了有C(4a)中间体的生成，并且HSP可以稳定C(4a)中间体。通过研究最终确定了HspB的催化机理，首先HSP形成了一个醌式中间体，醌式中间体的侧链取代碳原子与 C(4a)过氧化中间体反应生成一个碳四元中间化合物，该中间化合物与水中的氢氧根进行反应并最终通过retro-aldol分子内重排最终生成产物2,5-DHP和琥珀酸。 （二）首次报道了吡啶-吡咯烷混合途径（VPP）降解的基因簇并对其中三个关键酶的生化性质进行了研究。Ochrobactrum sp. SJY1是课题组筛选的一株能够利用VPP途径进行尼古丁代谢的菌株。已发表文献中没有该途径中功能基因的报道。本部分内容中，首先对菌株SJY1进行了全基因组测序。基因组测序拼接获得了一个长度为~97.6 kb的片段（vpp cluster），通过序列比对在vpp cluster中发现了6个与VPP代谢途径的催化反应相关的基因。这是第一次报道尼古丁代谢VPP途径的基因簇。本研究将其中的三个基因vppB，vppD和vppE进行了体外的克隆，表达和功能验证。结果显示VppB催化VPP途径中的第二步由6-羟基尼古丁到6-羟基N-甲基麦渥斯明的反应；VppD催化了HSP转化为2,5-DHP的反应；VppE蛋白催化了2,5-DHP的双加氧开环反应生成了N-甲基马来酰胺酸。 （三）利用基因工程菌株将尼古丁转化为高值化合物 HSP。尼古丁被认为是环境污染物，但同样也是一种重要的生物资源。在尼古丁代谢的过程中产生了许多高价值的中间产物。我们利用前面的研究，构建基因工程菌株生产高值化合物，通过基因失活实现目的化合物的积累。本部分研究内容通过对hspB基因失活构建了基因工程菌株P. putida P-HSP，利用该基因工程菌株可以成功的以尼古丁作为底物生产并积累HSP。在最优条件下利用连续补料反应，在23小时之内，基因工程菌株P-HSP可以转化生产16.2 g l-1 HSP，高于之前报道的HSP的产量。这是首次利用基因工程学手段对尼古丁降解菌株进行基因工程改造并应用于生产中间化合物，实现了环境污染物的变废为宝。