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本博士研究论文主要包括两方面的工作:一类新型的依赖于羟基自由基的化学发光体系;巯基化合物的新型保护机制研究。其中,每一方面的工作又包括了两部分的工作内容。整体博士阶段研究工作的详细摘要如下:
一、一类新型的依赖于羟基自由基的化学发光体系
1.一类新型的依赖于羟基自由基的二次化学发光产生体系:多卤代醌/过氧化氢
四氯苯醌(TCBQ)是广泛使用的木材保护剂——五氯酚的醌类代谢物之一,具有很强的基因毒性和致癌性。之前的研究表明,TCBQ与过氧化氢(H2O2)能通过不依赖于金属离子的反应途径产生羟基自由基(·OH),但是,其中详细的分子反应机制以及·OH参与的后续自由基反应的分子机制并不清楚。
本研究发现TCBQ与H2O2反应能产生一种非同寻常的二次化学发光,且该二次化学发光过程与TCBQ/H2O2反应体系的两次·OH形成过程相吻合。此外,研究还表明经典的羟基自由基清除剂(如DMSO等)能显着抑制TCBQ/H2O2体系产生的化学发光,而通过增加·OH的量(加入传统Fenton试剂如Fe(Ⅱ)-EDTA复合物产生额外的·OH)则能显着促进该体系的化学发光。在此基础上,通过运用多种化学分析手段,鉴定TCBQ与H2O2反应后的中间产物为三氯-羟基-1,4-苯醌,反应终产物分别为2,5-二氯-3,6-二羟基-1,4-苯醌,开环产物2,3-二氯马来酸、氯代丙二酸、草酸以及二氧化碳。基于上述数据及结果,我们推测在TCBQ与H2O2的反应过程中,生成了某种依赖于·OH的激发态多羰基中间产物,正是该激发态多羰基中间产物产生了不同寻常的化学发光,并同时分解产生多种醌环裂解产物。研究还发现,不仅TCBQ,其它四卤代醌如四溴苯醌等与H2O2反应也能产生类似的二次化学发光。
本文首次报道了一类新型的依赖于·OH的二次化学发光产生体系。上述发现具有重要的生物学与环境学意义,可作为一种新颖的化学分析于段用于定量检测和分析多卤代醌类及其母体卤代酚类化合物,为今后深入研究这些具有强烈肝毒性、肾毒性和致癌性的有机污染物提供了理论指导依据。
2.·OH产生体系导致2,5-二氯-3,6-二羟基-1,4-苯醌产生新型化学发光的研究
上述研究表明TCBQ与H2O2的反应是一种二次反应过程,该反应的二次反应终产物2,5-二氯-3,6-二羟基-1,4-苯醌(DDBQ)并不能与H2O2发生进一步的反应产生·OH及化学发光。然而,本研究发现,如果加入能产生·OH的Fenton试剂(Fe(Ⅱ)-EDTA/H2O2),则可使DDBQ产生显着的化学发光,进一步的研究表明DDBQ的这种化学发光强烈依赖于·OH,因为·OH清除剂如DMSO的加入可以显着抑制体系产生的化学发光。通过多种化学分析手段对反应过程的监测表明:在上述·OH产生体系导致的DDBQ化学发光过程中,DDBQ逐渐减少,并伴随着DDBQ结构中的两个氯原子完全脱除,生成反应终产物草酸和二氧化碳。综合上述研究结果,再结合之前提出的关于TCBQ/H2O2体系的化学发光机制,我们对DDBQ/Fe(Ⅱ)-EDTA/H2O2体系的化学发光提出了新型的依赖于·OH的化学发光机制。研究还发现,其它可产生·OH的反应体系(如VO2+/H2O2、Co2+/H2O2以及Cr3+/H2O2)也可导致DDBQ产生化学发光。此外,本研究发现的这类新型的依赖于·OH的化学发光产生体系还适用于多卤代酚类(卤代醌的前驱体)如五氯酚等。
本研究发现的这类新型的化学发光体系具有重要的环境分析意义,可用于定量检测痕量的过渡金属离子、多卤代醌类及其母体化合物多卤代酚类。
二、巯基类化合物的新型保护机制研究
1.经典铜络合剂青霉胺的新型抗氧化机理研究
青霉胺(β,β’-二甲基半胱氨酸)是一种传统的铜离子络合剂,在临床上其常用于治疗铜过量所致的Wilson氏疾病。本研究发现青霉胺能显着保护人纤维母细胞免于四氯氢醌(TCHQ,五氯酚的主要有毒代谢物之一)自动氧化所致的细胞毒性,而其他传统铜络合剂如浴铜灵则几乎没有任何保护作用。本研究通过电子自旋共振(ESR)及紫外-可见分析发现,TCHQ自动氧化会产生活性的四氯半醌自由基(TCSQ-)。然而,出乎意料的是,我们发现青霉胺能显着延迟TCHQ的自动氧化以及TCSQ-的形成,且这种延迟效应呈青霉胺浓度依赖方式。而相同条件下使用浴铜灵和二硫青霉胺(青霉胺的氧化形式)的反应体系中,则未发现类似的延迟TCHQ自动氧化的效应。进一步通过ESR和液相色谱-质谱(HPLC-MS)研究发现,青霉胺能将高活性的TCSQ-自由基还原为低活性的TCHQ,而青霉胺则被氧化为相应的二硫青霉胺。上述研究结果表明,青霉胺抑制TCHQ自动氧化所致的细胞毒性并不是由于其络合了金属铜离子,而是由于其将高活性的TCSQ°-还原为低活性的TCHQ。本研究首次发现了氨基巯基药物青霉胺具有上述一种意外的全新的类似抗氧化剂的特性,为今后深入研究青霉胺的生物学行为提供重要的指导意义。
2.麦角硫因保护铜所致DNA和蛋白质氧化损伤的新型作用机理:形成不具有氧化还原活性的麦角硫因-铜络合物
麦角硫因(2-巯基-组氨酸-三甲基内盐)是一种天然的氨基酸类似物,在生物组织和体液中通常以毫摩尔级浓度存在。尽管如此,麦角硫因的生物学功能及作用并不完全清楚。本研究深入探讨了麦角硫因对铜所致的DNA和蛋白质氧化损伤的影响及其可能扮演的角色。在研究中采用了两种含铜的反应体系:Cu(Ⅱ)/抗坏血酸体系以及Cu(Ⅱ)/H2O2体系。DNA和牛血清蛋白的氧化损伤分别通过DNA链断裂和蛋白质羰基化这两项指标来检测。研究结果表明,在两种含铜的反应体系中,麦角硫因(0.1-1.0 mM)都能显着保护DNA和蛋白质免于氧化损伤,并且这种保护作用具有剂量依赖效应,麦角硫因浓度越高,保护作用越强。与此相对照,经典的·OH清除剂(如DMSO和甘露醇)尽管浓度高达100mM,也只能提供很微弱的保护作用。此外,研究中通过紫外.可见以及低温电子自旋共振等分析手段发现,麦角硫因能明显抑制铜催化的抗坏血酸的氧化过程,并且还能与组氨酸及1,10-邻菲罗啉有效地竞争络合一价而非二价铜离子。从上述研究结果我们得知,麦角硫因是一种天然的含硫抗氧化剂,其可以通过形成不具有氧化还原活性的麦角硫因-铜的络合物形式,从而达到有效抑制金属铜离子所致的对生物大分子的氧化损伤。