【摘 要】
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犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)是单股DNA病毒,无囊膜,基因组全长5323bp,VP2全长1755bp,其编码的蛋白占整个衣壳蛋白的90%,是中和抗体的主要抗原表位,是制备CPV基因工程
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犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)是单股DNA病毒,无囊膜,基因组全长5323bp,VP2全长1755bp,其编码的蛋白占整个衣壳蛋白的90%,是中和抗体的主要抗原表位,是制备CPV基因工程疫苗的重要侯选保护性抗原。CPV可引出严重的出血性肠炎和心肌炎。该病一年四季皆可发生,发病急、病程短、传染性强、死亡率高,对实验犬、军犬、警犬等集中饲养的犬群具有很大的危险性,故对感染犬作出及时诊断,以便采取措施防止蔓延甚为重要。本研究对VP2基因分段进行原核表达,以CPV-VP2基因重组质粒为模板,通过蛋白质分析软件分析,把VP2基因分成不同区段,设计相应引物并扩增出相应片段。按常规方法克隆入pGEX-4T-2载体谷光甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳证明K2和K4片段获得了良好的可溶性表达,其表达的GST融合蛋白的分子质量分别为38.3KDa和41KDa,并对表达的融合蛋白进行了纯化。经过间接ELISA、Western blot鉴定,表明采用大肠杆菌原核表达系统所表达的融合蛋白具有与CPV阳性抗体特异结合的良好抗原性。用纯化的重组VP2融合蛋白作为筛选抗原,用提纯的CPV作为免疫原,经亚克隆得到6株稳定分泌CPV-VP2单抗的杂交瘤,分别命名为:3D9C4、4F11D5、5F10F5、4F9B7、4G9G11、5F11C11;中和试验表明:5F10F5、4F9B7、4G9G11、5F11C11四株有中和作用,且没有发生与犬类其他病毒发生交互反应的现象;经鉴定5F11C11和4G9G11相对具有较高的分泌抗体能力,腹水的效价在1∶10万倍以上。之后,用直接ELISA方法区分了5F10F5、4F9B7、4G9G11、5F11C11四株分泌的针对CPV不同抗原决定簇的几株单抗。结果表明,5F10F5、4G9G11与5F11C11针对不同抗原决定簇。上述成果可用于CPV特异性诊断、CPV病的抗体治疗、VP2蛋白功能的研究和CPV胶体金试剂条的研制。
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