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目的:运用Western blot、酶联免疫吸附法（ELISA法）蛋白检测技术对含有目的蛋白GTF/CTB的第三代（T3代）转基因生菜叶片进行鉴定及目的蛋白含量检测。通过免疫SD大鼠，初步探索含目的蛋白GTF/CTB防龋用转基因生菜的免疫原性及动物安全性。
方法:本研究包括三个部分
实验一转基因生菜中变异链球菌葡聚糖转移酶与霍乱毒素B亚单位嵌合目的蛋白含量的测定
用蛋白提取液提取转基因生菜总蛋白，BCA试剂盒测定其果实的总蛋白浓度;再根据Western blot分析由PCR筛选出含目的基因gtfB-ctxB的转基因生菜植株的目的蛋白表达情况，并用ELISA法对其浓度进行检测。
实验二转基因生菜防龋疫苗口服免疫SD大鼠的实验研究
(1)动物选择及分组:出生21天的SD雌性大鼠30只。建立龋齿模型，随机分成5组:实验组1:以5mL/(kg·d)剂量喂食含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜汁（含目的蛋白38.85μg）;实验组2:以10mL/(kg·d)剂量喂食含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜汁（含目的蛋白77.7μg）;实验组3:以20mL/(kg·d)剂量喂食含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜汁（含目的蛋白155.4μg）;阴性对照组:以10mL/(kg·d)剂量喂食非转基因生菜汁;阳性对照组:喂食灭活变异链球菌疫苗（1mL/次）。
(2)免疫途径:灌胃免疫。
(3)免疫时间:连续免疫4周，每周一次。
(4)样品收集时间:分别于首次免疫前一天和免疫后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12周采集血液、唾液样品（检测发现抗体水平降至接近初始水平则实验终止并处死动物）。
(5)特异性抗体的检测:用间接ELISA法检测血清中IgG和唾液中S-IgA。
(6)处死动物后称重并取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理学检查。取上下颌骨，根据Keyes经典评分方法进行龋齿计分。
实验三转基因生菜防龋疫苗动物安全性的研究
1、急性毒性实验
(1)动物的选择及分组:昆明小鼠50只，雌雄各半。随即分为5组。根据霍恩氏(Horn)法将含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜设4组(2.15、4.64、10和21.5g/kg）剂量的实验组和1组10g/kg剂量的非转基因生菜对照组来进行喂食。
(2)免疫方案:灌胃免疫，每日3次，连续灌胃1周。
(3)观察指标:①隔一天称量动物体重一次。②观察并记录实验动物的中毒症状和死亡情况。③第7天处死全部动物，取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理学检查。
2、亚慢性毒性实验
(1)动物选择:采用雌雄各半的健康成年SD大鼠。
(2)动物分组:随机将24只动物分成4组，每组雌雄各半。
实验组1:喂食剂量为2g/kg的含GTF/CTB蛋白的转基因生菜汁;实验组2:喂食剂量为6h/kg的含GTF/CTB蛋白的转基因生菜汁;实验组3:喂食剂量为10g/kg的含GTF/CTB蛋白的转基因生菜汁;阴性对照组:喂食剂量为10g/kg的非转基因生菜汁。
(3)免疫方案:根据动物体重变化而调整每天的灌胃量来定时灌胃，每天1次连续免疫30天。最后一次给药24h后处死动物。
(4)观察指标:①临床检查:每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒症状和死亡情况，每周称一次体重。②血液学检查:血色素、红细胞计数、白细胞计数及其分类、血小板数和网织红细胞数等。③血液生化学检查:谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、葡萄糖、血清白蛋白和类脂质等。④尿液检查:外观、PH、蛋白、糖、潜血及沉淀物镜检等。⑤脏器检查:肝肾的绝对质量和相对质量。⑥病理学检查:心肝脾肺肾固定保存并检查。
3、致突变试验
3.1骨髓微核试验:
(1)动物选择:健康昆明小鼠50只，雌雄各半。
(2)动物分组:随机将50只动物分成5组，每组雌雄各半。
实验组1:喂食剂量为2g/kg的含GTF蛋白的转基因生菜汁;实验组2:喂食剂量为5g/kg的含GTF/CTB蛋白的转基因生菜汁;实验组3:喂食剂量为10g/kg的含 GTF/CTB蛋白的转基因生菜汁;阴性对照组:喂食剂量为10g/kg的非转基因生菜汁;阳性对照组:喂食剂量40mg/kg的环磷酰胺。
(3)免疫方案:实验组和阴性对照组灌胃免疫，阳性对照组腹腔注射免疫。通过预实验采用30h给受试物法。即两次给受试物间隔24h，第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死动物。
(4)观察指标:制备小鼠骨髓涂片，在显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞数并取均值，计算微核率。
3.2精子畸形试验:
(1)动物选择:健康的雄性昆明小鼠30只
(2)动物分组:随机将30只动物分为5组，除阳性对照组采用50mg/(kg·d)环磷酰胺注射外，其他分组情况与骨髓微核实验相同。
(3)免疫方案:实验组和阴性对照组连续灌胃免疫5天，阳性对照组环磷酰胺腹腔注射免疫，连续5天，均为每天1次。首次给予受试物后的第35天处死动物。
(5)观察指标:制备小鼠精子涂片，在显微镜下计数结构完整精子并计算精子畸形率。
结果:
1、提取转基因生菜总蛋白样本经Western Blot检测在160KDa处出现特异性条带。并用BCA法及ELISA法测出含GTF/CTB转基因生菜外源目的蛋白约占植物可溶性总蛋白含量的0.053％。
2、各剂量实验组大鼠在用转基因生菜汁免疫1周后，血清特异性IgG水平和唾液特异S-IgA水平逐渐升高，实验组和阳性对照组特异性抗体水平明显高于阴性对照组（P＜0.05）;实验组与阳性对照组比较差异无统计学意义;各剂量组间比较差异不明显;阳性对照组和阴性对照组在龋损各级中均有明显差异(P＜0.05)，实验组和阳性对照组无统计学意义(P＞0.05)，实验组和阴性对照组只在Dx级无统计学差异。
3、①急性毒性实验的小鼠均未见毒性症状，实验组小鼠各脏器与阴性对照组比较差异均无统计学意义，半数致死剂量LD50＞21500mg/kg;②亚慢性毒性实验中雌雄大鼠均未见毒性症状，通过血常规检查、脏器系数和组织病理学检查，各剂量实验组与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05);③骨髓微核试验中3个实验组的骨髓微核发生率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05):而阳性对照组与其他各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05);精子畸形试验中3个实验组的雄性小鼠精子畸形率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05）;而阳性对照组与其他各组比较差异均有统计学意义(P＜0.05）。
结论:
1.在T3代含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜植株中检测出了有效表达的外源目的蛋白，其目的蛋白占可溶性总蛋白含量的0.053％。
2.SD大鼠经含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜免疫后，产生了抗变异链球菌葡聚糖转移酶GTF的血清和唾液抗体，其具有免疫原性，并能抑制龋齿的发生。
3.从大鼠转基因生菜急性和亚急性毒理实验、致突变试验的结果，初步证实含GTF/CTB目的蛋白的转基因生菜防龋疫苗是安全的，无潜在危害。