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巨大芽孢杆菌BM302和氧化葡萄糖酸杆菌GO112是经低能离子注入选育原始菌BM80和GO29而得到的2-酮基-L-古龙酸高转化率菌系。产酸转化率达到95％以上的历史最高水平。本文以离子注入前后的出发菌株BM80、GO29和突变株BM302、GO112为研究对象，研究了离子注入导致突变菌株生理、生化水平的变异；氧化葡萄糖酸杆菌关键代谢酶在分子水平上产生的突变；对巨大芽孢杆菌胞外液中具有产酸菌山梨糖脱氢酶活性激活促进作用的伴生蛋白进行了分离、纯化及基本酶学性质的探讨。以探讨离子注入效应对维生素C混菌二步发酵2-酮基-L-古龙酸高转化率的机理。本研究主要结果和结论如下：
⑴出发菌系和突变菌系生理、生化水平上的变异。单独培养的氧化葡萄糖酸杆菌表达产酸的全部酶系，但产酸量极低；单独培养的巨大芽孢杆菌不具备产酸的能力。巨大芽孢杆菌胞外液中分泌的碱性物质加速产酸菌的细胞增殖，提供了产酸菌有利的偏中性代谢环境；胞外液中的伴生蛋白成分，激活并提高了产酸菌中山梨糖脱氢酶的酶活。离子注入巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌后，其突变株的单独培养和混合发酵体系中，山梨酮脱氢酶活力和产酸量分别提高了0.27倍和1.18倍；离子注入使氧化葡萄糖酸杆菌GO112中山梨糖脱氢酶比活力提高了1.5倍。离子注入巨大芽孢杆菌后，对其自身的细胞生长量没有发生明显的影响，但突变株BM302明显加速了氧化葡萄糖酸杆菌的细胞增殖，表现为使产酸菌生长的延滞期缩短，对数期提前。突变菌株BM302分泌的碱性物质较BM80更能强化混菌发酵体系的pH值中和能力。发生在巨大芽孢杆菌伴生蛋白上的变异对混菌体系的产酸贡献作用更积极，体现在离子注入的巨大芽孢杆菌总胞外液分泌时间发生了改变且提高了产酸菌的糖酸转化能力。
⑵山梨酮脱氢酶(SNDH)表达载体的构建及突变分析。利用PCR方法从氧化葡萄糖酸杆菌GO112中扩增出了潜在编码其L-山梨酮脱氢酶的918 bp的完整开放阅读框，构建了L-山梨酮脱氢酶的重组表达载体pET-22b(+)-SNDH。重组蛋白分析表明L-山梨酮脱氢酶在E.coli BL21(DE3)中实现了了低水平表达，但亲和层析未得到纯化的重组蛋白。比较分析了GO29和GO112中L-山梨酮脱氢酶分子水平的突变，离子注入的突变株GO112中，潜在编码SNDH的核苷酸序列发生了2个CG→TA，1个GC→AT，1个TA→AT的点突变，相应的编码氨基酸发生了Leu→Phe，Arg→Gln，Asn→Lys的变化。其中第528 bp碱基处的CG→TA突变为同义突变，不导致氨基酸的变化；Arg202 Gln，Asn219 Lys为相同亲水性残基的取代；Leu155 Phe的变化可能使具苯环结构的苯丙氨酸潜在改变了SNDH的二级结构。
⑶巨大芽孢杆菌伴生蛋白(SAP)的分离、纯化及性质分析。以SDH酶活的提高为检测指标，建立了SAP活性检测体系并贯穿于整个SAP分离、纯化过程。采用超滤浓缩、离子交换层析、凝胶层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对巨大芽孢杆菌BM302胞外液中具有促进氧化葡萄糖酸杆菌山梨糖脱氢酶活性的伴生蛋白SAP进行了分离和纯化，SAP被纯化了35倍，得率13％，最终比活性5.21U/mg。SDS-PAGE测定SAP分子量约58 kDa，最适pH值为7.0，在偏碱性pH环境稳定；最适温度50℃，耐热性良好，60℃时仍能保留＞61％的活性。