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约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)分离于非洲的啮齿动物、是进行疟原虫致病性机理研究的重要实验模型。与恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和夏氏疟原虫(Plasmodiumchabaudi chabaudi)相比较,约氏疟原虫遗传学的研究一直有所滞后,其部分原因归咎于约氏疟原虫缺乏已开发的遗传标记和良好的表型特征。利用已知的基因组序列和具有不同表型的疟原虫虫株,本课题致力于约氏疟原虫微卫星遗传图谱的建立、以应用遗传连锁图谱对约氏疟原虫的疾病表型(如致病性毒力、抗药性和免疫原性等)进行研究。
本研究建立了一种简单、实用的约氏疟原虫微卫星分型方法,并鉴定了约600个能覆盖整个约氏疟原虫基因组的微卫星标记。对10株约氏疟原虫进行基因分型的结果表明,所鉴定的微卫星标记具有很高的多态性,系谱树状聚类分析显示所测的约氏疟原虫虫株形成了4个主要分支。这些微卫星标记随机分布于约氏疟原虫的14条染色体上,但在某些染色体中的分布并不均匀。与恶性疟原虫基因组相似的是,在约氏疟原虫基因组中的大部分微卫星标记也是富含AT的简单重复序列。
为了构建约氏疟原虫的遗传连锁图谱,以完成约氏疟原虫基因组序列的拼接、并探究该物种的相关遗传性状,本研究遴选了三对约氏疟原虫虫株用于遗传杂交,通过14次遗传杂交实验,共筛选出了75个独立的重组克隆子代,并构建了约氏疟原虫第一张高分辨率的遗传连锁图谱。基于数百个微卫星标记的重组克隆子代的遗传分离模式,将隶属于14条染色体的遗传标记聚类形成了14个连锁群,使得一些序列重叠群contigs可以精确地定位到相应的染色体上。与以往报道的恶性疟原虫和夏氏疟原虫遗传图谱相比较,本研究获得的约氏疟原虫遗传图谱的重组单位相对较大,为39.7 kb/cM,这说明约氏疟原虫的重组交换率较低。
应用数量性状基因座位(quantitative trait loci,QTL)分析一组遗传杂交(17XNL×N67)的生长速度性状显示,一个主效座位(位于染色体13)和两个次效座位(位于染色体10和染色体7)与生长速度相关的毒力性状相连锁。其中位于染色体13和位于染色体10的基因座位连锁于感染后第5天(day-5)生长速度性状(原虫率),两个贡献座位间的作用是具独立的加性效应;而位于染色体7的基因座位与感染后第10天(day-10)生长速度性状相连锁。染色体13贡献座位的区间跨度为～220 kb,含有28个约氏疟原虫序列contigs,共有51个预测基因,其中包含一个约氏疟原虫红细胞结合配体(PyEBL)编码基因。我们的研究还发现PvEBL蛋白R6结构域上c741Y的突变能导致疟原虫致病性毒力和生长速度的改变。染色体10贡献座位的区间跨度为～234 kb,也含有28个约氏疟原虫序列contigs,共有71个预测基因,包括一个能介导裂殖子黏附和入侵红细胞的棒状体蛋白Py235家族编码基因。此外,一些重组子代也产生了新的致病性毒力和生长速度性状。
约氏疟原虫微卫星标记的筛选与鉴定、遗传连锁图谱的构建,为开展约氏疟原虫基因分型、致病性毒力以及其它疟原虫生物学研究提供了重要的遗传信息和工具。