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海洋沉积环境微生物多样性丰富,包含了海洋系统75%的细菌,同时具有高压、低温、黑暗、高盐等特点,这些特征使其成为孕育嗜盐及耐盐细菌的摇篮。在极端嗜盐古菌的研究已经较为透彻的今天,嗜盐及耐盐细菌因其独特的生理特性越来越受到研究人员的重视。本研究采用纯培养技术手段,以挖掘具有应用潜力的菌种和新物种资源出发,对海洋沉积环境嗜盐及耐盐细菌多样性及其生理特性进行深入调查。
为了得到尽可能多的嗜盐及耐盐细菌类群,我们采用多种分离方法。通过设置多个NaCl浓度梯度和使用多种分离培养基,发现不同分离方法下获得细菌类群差异较大。首先,在同一深度范围内,随着NaCl浓度的升高,菌株数目呈明显下降趋势,获得属级类群存在较大差异;不同NaCl浓度下优势门级类群均为厚壁菌门(Firmicutes),优势属级类群为芽孢杆菌属(Bacillus)和喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)。其次,不同分离培养基获得细菌类群差别较大,从10%TSB(多个盐浓度)分离培养基得到最多属级类群,各个培养基获得菌株最多的属级类群为Bacillus属和Halobacillus属。
对所有菌株进行盐度实验,发现人工高盐环境下获得海洋沉积环境来源细菌分布在6个生理类群,即非嗜盐菌(生长盐度范围0-5%,最适生长盐度0-1.5%)、耐盐菌(生长盐度范围0-20%,最适生长盐度0-1.5%)、广域嗜盐菌(生长盐度范围0-30%,最适生长盐度3%-15%)、低度嗜盐菌(生长盐度范围1.5%-30%,最适生长盐度3%-5%)、中度嗜盐菌(生长盐度范围1.5%-30%,最适生长盐度5%-20%)及临界极端嗜盐菌(生长盐度范围5%-30%,最适生长盐度15%-20%)。优势生理类群为广域嗜盐菌,其次为中度嗜盐菌和耐盐菌,非嗜盐菌、低度嗜盐菌及临界极端嗜盐菌所占比例很小,暂未发现极端嗜盐菌。各个生理类群的优势菌株均分布在Firmicutes门,而不同分离条件与获得特定生理类群并未发现直接关系。
部分嗜盐菌株的酶活初筛结果表明,多数菌株具有蛋白酶、淀粉酶和酯酶酶活,并未发现具有水解纤维素活性的菌株。通过海洋专性生长菌株筛选实验发现了大量依赖海水生长的菌株资源。这些生理生化实验结果向我们展示了所获得菌种资源的巨大应用价值。
通过设计不同浓度盐(NaCl)的培养基分离获得869株细菌,经16SrRNA基因序列测定初步确定了729个菌株的系统进化地位,分布于4个门,54个属,149个种,Bacillus属和Halobacillus属为优势类群。盐耐受实验结果表明以上149个物种有129个属于嗜盐或耐盐类群,它们分布于4个门级类群中的27个科级系统发育类群,47个属级系统发育类群。进一步分析发现,不同深度沉积环境样品嗜盐及耐盐细菌类群差别较大,Bacillus属和Halobacillus属在各个深度范围都有发现。同时,细菌多样性随深度增加呈现递减趋势。
系统发育分析结果表明,本研究共获得15个潜在新分类单元,其中10个为嗜盐或耐盐细菌,分布在Firmicutes和Bacteroidetes两个门。通过形态特征,生理生化特征,化学分类特征以及基于16SrRNA的系统发育进化分析等指标对两株潜在新物种进行了多相分类研究,确定了其系统发育进化地位。目前,已经完成其中两个新种Bacillusoceanisp.nov.及Paenibacillusmarmussp.nov.的分类描述,其他新种鉴定工作正在进行中。