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干细胞因具有“无限”增殖和自我更新的特点，利用干细胞保存动物遗传资源将得到逐步认可与应用。但目前家禽干细胞仍存在分离培养效率低、生物学特性研究尚不明确等问题。因此，本实验研究了鸡原始生殖细胞和软骨干细胞体外分离方法、体外培养体系及其生物学特性，实验结果如下： 1.采用胰酶消化法分离鸡原始生殖细胞于鸡胚成纤维细胞上培养，细胞呈集落式生长;对纯化细胞进行碱性磷酸酶和PAS染色，细胞集落分别呈现蓝紫色和红色阳性表达，并且集落具有形成类胚体能力;对细胞进行核型检测，含有78条染色体，其中包含10对大染色体和29对微小染色体;对纯化细胞进行表面分子标志鉴定，免疫荧光检测显示c-Kit、Oct4、SSEA-1、SSEA-3和SSEA-4表达阳性，RT-PCR结果显示Kit、Nanog、Sox2、DAZL和POUV均表达阳性。以上结果显示，所分离细胞集落为原始生殖细胞。利用成上皮诱导液对鸡原始生殖细胞进行诱导分化，诱导后的细胞进行免疫荧光鉴定，CK-18和CK-19上皮标记基因呈阳性表达;利用成肝诱导液对鸡原始生殖细胞进行诱导分化，诱导后的细胞进行糖原染色呈阳性，诱导后细胞与肝细胞形态相符，RT-PCR检测到肝细胞特异分子标记AFP和ALB;利用成软骨诱导液对鸡原始生殖细胞进行诱导分化，诱导后细胞用阿利新蓝染色可见蓝色类似软骨样细胞团，RT-PCR检测到软骨细胞分子标记COL2A1、VIM、SO9和ACAN;利用精子诱导液对鸡原始生殖细胞进行诱导分化，诱导后细胞呈精子样生长。结果显示，原始生殖细胞具有多潜能性，可向不同胚层细胞和生殖细胞分化。 2.采用链蛋白酶和胶原酶Ⅱ连续消化法分离鸡软骨干细胞，在体外可传代培养到22代。细胞呈长梭形间充质干细胞样生长，细胞核较大;生长曲线显示不同代次细胞具有不同的增殖能力;对细胞进行核型鉴定，符合鸡核型标准，包含10对可见染色体;对纯化细胞进行软骨干细胞和间充质干细胞表面分子标志鉴定，免疫荧光检测显示Collgen1、Collgen2、Aggrecan1、Vimentin、Fgfr3和Sox9表达阳性，RT-PCR结果显示COL2A1、VIM、SOX9和ACAN均表达阳性;利用流式细胞仪，对分离细胞进行阳性率检测，CD29、CD44、CD166和CD105间充质干细胞标记基因阳性表达率均高于98％。以上结果表明，所分离细胞为软骨干细胞。利用成脂诱导液对软骨干细胞进行诱导分化，诱导后的细胞进行油红O染色，可见红色脂滴，RT-PCR检测到脂肪细胞特异性分子标记LPL和PPAR-γ;利用成骨诱导液对软骨干细胞进行诱导分化，诱导后细胞进行茜素红染色呈阳性，RT-PCR检测到成骨细胞特异性分子标记COL1A2和SPP1;利用成软骨诱导液对软骨干细胞进行3D培养，诱导后细胞团形态类似软骨球，对其进行石蜡切片，并进行阿利新蓝和甲苯胺蓝染色呈阳性，在对其进行免疫荧光染色，COL1A2和COL2A1均表达阳性。结果表明，软骨干细胞为专能干细胞。 综上所述，本实验在体外成功分离了鸡原始生殖细胞和鸡软骨干细胞，并对其生物学特性进行了研究，对鸡多潜能干细胞和专能干细胞的获得奠定了基础，对禽类遗传资源保存具有重要意义。